ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T33682—2017 基质辅助激光解析电离飞行时间 质谱鉴别微生物方法通则 General microganism identification method with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry 2017-12-01实施 2017-05-12发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33682—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：国家农业标准化监测与研究中心（黑龙江）、中国测试技术研究院、深圳出人境检 验检疫局、卫生部北京医院、梅里埃诊断产品（上海）有限公司、北京威泰科生物技术有限公司。 本标准主要起草人：彭丽萍、周李华、姜雯、吕敬章、王志强、张秀珍、孔鲁、胡云建、王海宽、 陆俊杰、张春红、王科、徐凤霞、张滨滨。 GB/T33682—2017 基质辅助激光解析电离飞行时间 质谱鉴别微生物方法通则 1范围 本标准规定了基质辅助激光解析电离飞行时间质谱鉴别微生物的方法通则。 本标准适用于各类从事微生物相关检验工作实验室对样品中的微生物进行快速鉴定以及研究，可 鉴定微生物种属。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.10一2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18204.3—2013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 全微生物蛋白质指纹图谱 microbial protein fingerprinting 未经处理的微生物菌苔（如固体培养基上的菌落），直接涂于靶板上，待干燥后加上基质混合，全细 菌可溶性蛋白与基质形成共结晶体后通过真空飞行时间管获取不同质电荷比的蛋白分子质谱指纹 图谱。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CHCA：a-氰基-4羟基肉桂酸（a-Cyano-4-hydroxycinnamicacid) DHB:2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoicacid) MALDI-TOFMS：基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（Matrix-AssistedLaserDesorption/Ioni zation Time of FlightMass Spectrometry) 5 原理 常见微生物都由其区别于其他种类的特殊蛋白质组成，因而拥有独特的蛋白质指纹图谱，这是由物 种的遗传特性所决定的，受外界环境条件等影响较小。 样品（来自痰、血、体液、拭子等临床样本及食品、化妆品、药品及环境等）经适当的处理，在固体培养 1 GB/T33682—2017 基上培养、分离出单个菌落后，直接点样至靶板并将其放入基质辅助激光电离解析飞行时间质谱 （MALDI-TOFMS）内，经离子化按照质量/电荷（m/）比值大小分离，将采集的数据与微生物指纹图 谱库对照鉴定。 6试剂与标准品 除非有特殊说明，仅使用色谱纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。 6.1甲酸(HCOOH)。 6.2 2乙腈(CH,CN)。 6.3 3 乙醇(CH,CH2OH)。 6.4 4三氟乙酸(CF.COOH)。 6.5 5磷酸盐缓冲液：pH7.2。 6.6 6a-氰基-4羟基肉桂酸（Cl.H,NOs），光谱纯。 6.72,5-二羟基苯甲酸（C,HO）,光谱纯 6.8 3血琼脂培养基：按照GB4789.102016中A.2的规定执行。 6.9 沙氏琼脂培养基：按照GB/T18204.3一2013中4.2.2.1的规定执行。 6.10 标准菌株：ATCC8739大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）。 7 仪器与设备 7.1 MALDI-TOFMS。 7.2 二级生物安全柜。 7.3 7.47 离心机：12000r/min。 7.5 旋涡混合器。 6显微镜。 7.6 7.7 微量移液器及枪头。 7.8 一次性或重复使用靶板。 7.9 1μL接种环。 8 试验方法 8.1 微生物的培养 8.1.1 培养前处理 痰、血、体液、拭子等临床样本经采集后直接接种。其他固体样品需粉碎，加入无菌磷酸盐稀释液溶 解，液体样品可不经过溶解 8.1.2微生物培养 一般细菌划线接种血琼脂培养基，36℃土1℃培养24h土2h；酵母划线接种沙保弱葡萄糖琼脂培 规定的培养基和培养方法执行。 2