ICS 71.040.30 G 66 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 33410—2016 生化试剂中蛋白酶K活性检测方法 Determination of the activity of protease K in biochemical reagents 2016-12-30发布 2017-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T33410—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：深圳市计量质量检测研究院、中国测试技术研究院、中国标准化研究院 本标准主要起草人：林霖、周李华、赖心田、兰全学、马爱进、陈国培、李浙、潘兰芳、杨国武 GB/T33410—2016 生化试剂中蛋白酶K活性检测方法 1范围 本标准规定了生化试剂中蛋白酶K活性检测方法。 本标准适用于分子生物学实验中使用的蛋白酶K活性的测定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 蛋白酶K活性单位 proteaseKactivityunit 在55℃，pH8.0时,1min内水解酪蛋白产生1μgL-酪氨酸为一个酶活性单位。 注：活性单位为U/mg、U/g或U/mL。 4原理 蛋白酶K是一种切割活性较广的丝氨酸蛋白酶，可催化含有较多的丝氨酸位点的α-酪蛋白水解。 本方法中采用α-酪蛋白为反应底物，经蛋白酶K催化水解为L-酪氨酸，在275nm处测定吸光度值。再 通过测量各个浓度的L-酪氨酸标准溶液在275nm处的吸光度值，并构建标准曲线得出线性回归方程， 以外标法定量。计算蛋白酶K的酶活性。 5仪器设备及器具 5 5.1 恒温水浴锅：控温精度王0.2℃。 5.2pH计：精确至0.01pH。 5.3# 紫外-可见分光光度计：吸光度值精确至0.001。 5.41cm石英比色皿l。 5电子天平：感量0.0001g。 5.5 6试剂 除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6882规定的三级水。 1 GB/T33410—2016 6.10.01mol/LTris·HCI缓冲液(pH8.0) 称取12.11gTrisbase（三甲基氨甲烷盐酸盐）加人适量去离子水使其溶解，定容到100mL，得 1mol/LTris·HCl缓冲液，用浓盐酸调至pH8.0;再取1mL1mol/LTris·HCI缓冲液加去离子水 定容至100mL,即得0.0l mol/LTris·HCl缓冲液。 6.20.4mol/L三氯乙酸溶液 称取三氯乙酸65.40g，用去离子水溶解并定容至1000mL。 6.3HCI溶液 量取8.33mL浓盐酸加人到50mL去离子水中，定容至100mL，得1mol/LHCl 量取10.00mL1mol/LHCl加去离子水定容至100mL，得0.1mol/LHCl。 6.40.5mol/LNaOH溶液 称取2gNaOH，溶解于50mL去离子水中，定容至100mL。 6.510g/L酪蛋白溶液 称取酪蛋白标准品1.000g，用少量0.5mol/LNaOH溶液（6.4）湿润后，加人0.01mol/LTris·HCl 缓冲液（6.1)约80mL，在沸水中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转移至100mL容量瓶中，用适量 0.01mol/LTris·HCl缓冲液（6.1)定容至刻度。置于4℃保存备用。 6.6100μg/mLL-酪氨酸标准储备液 称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g用60mL1mol/LHCl溶液（6.3)溶解后定 容至100mL，配成1mg/mLL-酪氨酸标准溶液。再吸取1mg/mLL酪氨酸溶液10.00mL，用0.1mol/L 盐酸溶液（6.3)定容至100mL,即得到100ug/mL的L-酪氨酸标准储备液。注意避光保存。 7 分析步骤 7.1 标准曲线的绘制 7.1.1L-酪氨酸标准溶液 按表1配制L-酪氨酸标准溶液。 表1L-酪氨酸标准溶液配制 酪氨酸标准溶液的浓度 加入100μg/mL酪氨酸标准溶液的体积 加人去离子水的体积 管号 μg/mL mL mL 0 0 0 10 1 20 2 8 2 40 4 6 3 60 9 4 4 80 8 2 5 100 10 0 2