ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T33119—2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Eutypa lata (Pers.) Tul.et C.Tul 2016-10-13发布 2017-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 33119—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检疫局、中华人民共和国湖北出人境检 验检疫局、中国科学院微生物研究所。 本标准主要起草人：干英超、段维军、厉艳、吴兴海、封立平、魏晓棠、甘琴华、纪瑛、邵秀玲、姚剑、 王振华、郭立新、蔡磊。 I GB/T33119—2016 葡萄藤猝倒病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了葡萄藤猝倒病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于葡萄等寄主植物中葡萄藤猝倒病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 3葡萄藤猝倒病菌基本信息 学名:Eutypa lata(Pers.)Tul.et C.Tul. 异名:Eutypa armeniacae Hansf.& M.V.Carter;Eutypa frarini(Nitschke) Sacc;Eutypa mil liaria(Fr.) Sacc.; Eutypa lata var.aceris Rappaz,Mycol,Helv;Cytosporina lata Hohn; Libertella blepharisA.L.Sm. 分类地位：采用《真菌词典》第10版分类系统，葡萄藤猝倒病菌（Eutypalata）属真菌界（Fungi)，子 囊菌门（Ascomycota），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌纲（Sordariomycetes），炭角菌目 （Xylariales），蕉孢壳科（Diatrypaceae），弯孢壳属（EutypaTul.&C.Tul.1863）。 传播途径：植物体在贸易和运输中能够传播该病害。植物体主要指树皮（孢子和菌丝），地上部分的 茎、嫩枝、主干、枝条（菌丝），木材（孢子和菌丝）等。 葡萄藤猝倒病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 葡萄藤猝倒病菌的为害症状、分离培养性状、形态特征和特异性PCR检测结果等是该检疫鉴定方 法的主要依据。 5仪器设备和主要试剂 5.1 仪器设备 生物显微镜、电子天平（感量0.001g）、离心机（12000g）、普通冰箱、超低温冰箱（一80℃）、涡旋振 荡器、恒温光照培养箱、高压灭菌器、生物安全柜、PCR仪、电泳仪、凝胶分析成像系统、可调微量加样 器、全自动DNA提取仪。 1 GB/T33119—2016 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定。 0.5%次氯酸钠（NaCIO）、葡萄糖、琼脂、硫酸链霉素、盐酸金霉素、氯硝胺 6现场检疫 按照SN/T2589，仔细检查寄主植物的茎、枝条、叶片等部位是否出现疑似症状（参见附录A）。茎 部主要看有无溃疡症状；枝条是否长势短小，发育受阻，着生的叶子是否萎黄，卷缩变形或破碎；顶部是 否出现枯萎症状。对可疑植物、繁殖材料应取样送实验室做进一步检验，取样方法和步骤参照 SN/T 2122. 7实验室检疫 7.1PCR凝胶电泳初筛检测 将第6章中的可疑植物、繁殖材料等样品进行PCR初筛检测,PCR凝胶电泳检测见附录B。对于 阳性结果进行下一步检测。 7.2病原菌的分离和培养 7.2.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基和选择性培养基的制备 分离培养时加硫酸链霉素（100μg/mL）、盐酸金霉素（50μg/mL）、氯硝胺（5μg/mL）作为选择性培 养基。 7.2.2病原菌检查 检查寄主的树皮、枝条等组织有无子座、子囊壳，在显微镜下观察病菌的子囊壳，记录其形态特征， 测量子囊和子囊孢子的大小。所获得分离物在马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行单孢分离纯化。 7.2.3组织中病原菌的分离和培养 如果发现可疑症状，但不能按7.2.2进行有性型形态检查，应采取下列分离培养的方法做进一步的 鉴定。剥去树皮，纵向劈开树干露出内部溃疡的边缘。在无菌条件下，从溃疡部分的外部边缘切取 1cm的薄木片，放在0.5%次氯酸钠溶液中浸泡2min～5min，用无菌水重复洗3次，然后用无菌滤纸 吸干，放在选择性培养基上进行培养。24℃培养4d～7d后，将疑似菌落转到马铃薯葡萄糖琼脂培养 基上进行分离纯化， 8鉴定特征 8.11 PCR凝胶电泳初筛检测 判定结果见附录B。 8.2培养性状 葡萄藤猝倒病菌在PDA培养基首先形成白色棉絮状菌丝，培养基背面奶油色。2周后，培养基上 2