ICS 65.100 B 17 中华人民共和国国家标准 GB/T 15670.20—2017 农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因 突变试验 Toxicological test methods for pesticides registration- Part 20:In vitro mammalian cell gene mutation test 2018-02-01实施 2017-07-12 发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 15670.20—2017 前言 GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分： 第1部分：总则； 第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法； 第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法； 第5部分：急性经皮毒性试验； 一第6部分：急性吸入毒性试验； 第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验； 第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验； 第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验； 第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验； 第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验； 第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验； 第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验； 第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：啮齿类动物显性致死试验； 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验； 第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验； 第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验； 第23部分：致畸试验； 第24部分：两代繁殖毒性试验； -第25部分：急性迟发性神经毒性试验； 第26部分：慢性毒性试验； 一第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验； 第29部分：代谢和毒物动力学试验。 本部分为GB/T15670的第20部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所。 本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江。 1 GB/T15670.20—2017 农药登记毒理学试验方法 第20部分：体外哺乳动物细胞基因 突变试验 1范围 GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞基因突变试验的基本原则、方法和要求 本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞基因突变试验。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T15670.14一2017农药登记毒理学试验方法第14部分：细菌回复突变试验 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 正向突变forwardmutation 野生型基因经过突变成为突变型基因的过程，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。 3.2 碱基置换型致突变物 basepair substitutionmutagens 引起DNA分子中一个或多个碱基对置换的物质。 3.3 frameshiftmutagens 移码型致突变物 引起DNA分子增加或丢失一个或多个碱基对的物质。 3.4 表型表达时间phenotypicexpressiontime 新突变的细胞耗尽改变的基因产物所需的时间。 3.5 mutant frequency 突变频率 所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值 4试验目的 本试验用于检测受试物对体外培养的哺乳动物细胞的基因突变作用，包括碱基对突变、移码突变和 缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性。 1 GB/T15670.20—2017 5试验概述 化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞传代培养。胸苷激酶水平正常的细胞对三 氟胸苷（trifluorothymidine，TFT)等敏感，因而在培养液中不能生长分裂，突变细胞则不敏感，在含有三 氟胸苷的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。相似的，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基酶（HPRT)正 常的细胞对6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG)敏感，突变的细胞则不敏感，在含有6-硫代鸟嘌呤的选 择性培养液中可生长形成集落。基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。 6试验方法 6.1 受试物和试剂 6.1.1受试物 6.1.1.1 受试物的配制 固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加人试验系统，或 用前稀释至适合浓度。受试物应在使用前新鲜配制，否则应证实贮存不影响其稳定性。 6.1.1.2溶剂的选择 溶剂应是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。首选溶剂是水或水 溶性溶剂。三甲基亚磁（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应天于0.5%。 6.1.1.3受试物浓度设置 6.1.1.3.1最高浓度的选择 决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压（osmolality)的 改变。 6.1.1.3.2细胞毒性的确定 应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例 如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（totalgrowth）。应在预试验中确定细胞毒性和溶解度。 6.1.1.3.3剂量设置 通常浓度间隔系数在2～V10之间。 如最高浓度是基于细胞毒性，则该浓度组的细胞相对存活率（相对集落形成率）或相对细胞总生长 情况应为10%~20%（不低于10%）。 对于细胞毒性很低的化合物，最高浓度应是5uL/mL，5mg/mL或0.01mol/L。 对于相对不溶解的物质，其最高浓度应达到或超过在细胞培养状态下的溶解度限值。最好在试验 处理开始和结束时均评价溶解度，因为由于S9等的存在，试验系统内在暴露过程中溶解度可能发生变 化。不溶解性可用肉眼鉴别，但沉淀不应影响观察。 2