ICS 65.100 B 17 中华人民共和国国家标准 GB/T 15670.22—2017 农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验 Toxicological test methods for pesticides registration- Part 22:DNA damage and repair/unscheduled DNA synthesis test in mammalian cells in vitro 2017-07-12发布 2018-02-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 15670.22—2017 前言 GB/T15670《农药登记毒理学试验方法》分为以下部分： 第1部分：总则； 第2部分：急性经口毒性试验霍恩氏法； 第3部分：急性经口毒性试验序贯法； 第4部分：急性经口毒性试验概率单位法； 第5部分：急性经皮毒性试验； 一第6部分：急性吸入毒性试验； 第7部分：皮肤刺激性/腐蚀性试验； 第8部分：急性眼刺激性/腐蚀性试验； 第9部分：皮肤变态反应（致敏）试验； 第10部分：短期重复经口染毒（28天）毒性试验； 第11部分：短期重复经皮染毒（28天）毒性试验； 第12部分：短期重复吸入染毒（28天）毒性试验； 第13部分：亚慢性毒性试验； 第14部分：细菌回复突变试验； 第15部分：体内哺乳动物骨髓嗜多染红细胞微核试验； 第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验； -第17部分：哺乳动物精原细胞/精母细胞染色体畸变试验； 第18部分：啮齿类动物显性致死试验； 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验； 第20部分：体外哺乳动物细胞基因突变试验； 第21部分：体内哺乳动物肝细胞程序外DNA合成（UDS)试验； 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验； 第23部分：致畸试验； 第24部分：两代繁殖毒性试验； -第25部分：急性迟发性神经毒性试验； 第26部分：慢性毒性试验； 一第27部分：致癌试验； 第28部分：慢性毒性与致癌合并试验； 第29部分：代谢和毒物动力学试验。 本部分为GB/T15670的第22部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由中华人民共和国农业部提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所。 本部分主要起草人：张宏伟、张丽英、陶传江。 1 GB/T15670.22—2017 农药登记毒理学试验方法 第22部分：体外哺乳动物细胞DNA损害 与修复/程序外DNA合成试验 1范围 GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验的基本 原则、方法和要求， 本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞DNA损害与修复/程序外DNA合成试验。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 程序外DNA合成unscheduledDNAsynthesis；UDS 发生在细胞周期的S期半保留DNA程序合成之外的DNA合成。 2.2 净核银粒netnucleargrain；NNG 在放射自显影UDS试验中细胞内UDS活性的定量测定，计算为核银粒数（NG)减去等于核面积的 细胞质内银粒平均数（CG），即NNG=NG一CG。由各细胞计算NNG数，再将一个培养物或平行培养 物中的细胞NNG汇总 3试验目的 该测试系统是通过对DNA修复合成水平的检测来评价受试物能否对原代哺乳动物细胞和已建立 的哺乳动物细胞系的DNA造成损伤及损伤的程度。由于UDS反映损伤的切除修复过程，并反映出损 伤的程度，因此可作为化学致癌剂短期生物学试验的判断终点。 4试验概述 将分离和培养的非S期哺乳动物细胞移人含胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）和受试物的培养瓶中，孵育 一定时间后，观察H-TdR掺入情况，如果受试物造成了细胞DNA损伤，必然引起细胞的自主性DNA 修复，在修复过程中3H-TdR整合人DNA链中，造成H-TdR在修复后DNA中的掺入。再用放射性自 显影或液体闪烁计数的方法来观察掺入H-TdR的量，掺入越多，说明受试物对DNA的损伤越广泛 除非采用肝原代细胞作为靶细胞，培养的哺乳动物细胞均要在加和不加外源性代谢活化系统两种 情况下与受试物作用。 鉴于原代培养肝细胞存在易于分离培养、保留肝微粒体酶系等优点，建议用原代培养肝细胞作为试 验的靶细胞。 1 GB/T15670.22—2017 5试剂与器材 5.1试剂 注：全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。 5.1.1细胞增殖用培养基 Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）85份，小牛血清15份，加人青霉素、链 霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100ug/mL。EMEM培养基可选用 各种商品供应的粉未培养基按生产厂商提供资料配制并除菌，4℃冰箱必存。 5.1.2同步用培养基 不含精氨酸的Eagle氏最低必需培养基（minimalessentialmedium，Eagle）98份，小牛血清2份， 青霉素、链霉素浓度同细胞增殖用培养基。 5.1.3Hanks平衡盐溶液（HBSS） 于800mL双蒸水（50℃～60℃）中。另取无水氯化钙2.8g溶于100mL双蒸水中。将上述两溶液混 合后，加水至1000mL，加人三氯甲烷2mL，保存于4℃中。 贮液B：将磷酸氢二钠（NazHPO±·12H,O)3.04g（或NazHPO·2HzO1.2g）、磷酸二氢钾 (KH,PO,·2HO)1.2g（或KH,PO,0.95g）、葡萄糖20g溶解于800mL双蒸水中，加人100mL 0.4%酚红溶液（取酚红1g，溶于3mL1mol/L氢氧化钠中，待完全溶解后.加入双蒸水中至250mL）， 加水至1000mL，加人三氯甲烷2mL，保存于4℃中。 贮液C：1.4%碳酸氢钠，以双蒸水配制。 应用液的配制：取A液1份，B液1份，水18份，混合后分装于玻璃容器内，高压灭菌，4℃保存。 用前加入1.4%碳酸氢钠，将pH调整至7.2~7.4。 5.1.4磷酸缓冲液（无钙、镁的Dulbecco氏磷酸缓冲盐液）（pH7.4) 取氯化钠8.00g、磷酸二氢钾0.20g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠（Na2HPO·12H2O)2.89g溶于 1000mL双蒸水中。 5.1.50.02%乙二胺四乙酸二钠或四钠（EDTA）溶液 取EDTA0.2g溶于无钙、镁的磷酸缓冲液中，使成1000mL。高压灭菌后使用。 5.1.6抗菌素贮存液 取临床注射用青霉素G100万单位及链霉素1g粉针，在无菌操作下溶于100mL灭菌蒸馏水中， 使青霉素及链霉素在溶液中的浓度分别为1万单位及10000ug/mL，使用时每100mL培养基中加人 抗菌素贮存液1mL。 5.1.7大鼠肝微粒体S9混合液（10%） 每10mL由以下成分组成，临用时配制： 磷酸盐缓冲液（0.2mol/L，pH7.4) 6.0 mL 氯化钾溶液（1.65mol/L） 0.2 mL 2