ICS 65.020.30 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 40251—2021 牡蛎单孢子虫病诊断规程 原位杂交法 Code of diagnosis for MsX disease of oysters-In situ hybridization method 2021-12-01实施 2021-05-21发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40251—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口。 本文件主要起草人：白昌明、杨冰、王崇明、黄健、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨、余卫忠 1 GB/T 40251—2021 牡蛎单孢子虫病诊断规程 原位杂交法 1范围 本文件规定了牡蛎单孢子虫病诊断规程中病原定位方法的要求，针对主要病原尼氏单孢子虫 （Haplosporidiumnelsoni），给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果 判定。 本文件适用于尼氏单孢子虫在牡蛎中感染程度的评估和确诊其他贝类也可参照执行。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 SC/T7205.1—2007 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AP：碱性磷酸酶（alkalinephosphatase) BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐（5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphatep-toluidinesalt） DAFA：戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液（davidson’salcohol-formalin-aceticacidfixative） DIG：地高辛（digoxigenin) hydrate) MgClz·6H,O：六水合氯化镁（magnesiumchloridehexahydrate) NaCl:氯化钠（sodium chloride) Na,HPO4·12H,O：十二水合磷酸氢二钠（sodiumphosphatedibasicdodecahydrate） Na：C,H,O，·2H，O：二水合柠檬酸三钠（sodiumcitratedihydrate)） NBT：氯化硝基四氮唑蓝（4-Nitrobluetetrazoliumchloride） KH,PO4：磷酸二氢钾（potassiumphosphatemonobasic) KCl:氯化钾（potassiumchloride) PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebuffersalinebuffer） SSC：枸橡酸钠缓冲液（salinesodiumcitratebuffer） Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris[hydroxymethylJaminomethane） 1 GB/T 40251—2021 TritonX-1o0:聚乙二醇辛基苯基醚（Polyethyleneglycoltert-octylphenylether) 5试剂或材料 5.1 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。 5.2 NaCl。 5.3 3NasCH.O,·2H2O。 5.4KCl。 5.5 5Na2HPO4·12H,O。 6KH,PO4。 5.6 5.7 Tris。 5.8 TritonX-100。 5.9 9MgClz·6H,0。 5.10 EDTA-Na2 · 2H2O。 5.11 NBT。 5.12 BCIP。 5.13 蛋白酶K。 5.14 多聚赖氨酸（相对分子质量25000）。 5.15 聚乙烯醇（相对分子质量30000～70000）。 5.16 盐酸左旋咪唑。 5.17 俾斯麦棕Y。 5.18 牛血清白蛋白。 5.19 聚蔗糖400。 5.20 聚乙烯吡咯烷酮360。 5.21 寡聚核苷酸探针MSX1347,序列：5'-ATG-TGT-TGG-TGA-CGC-TAA-CCG-3'合成时用DIG 标记的脱氧核糖核苷尿嘧啶代替脱氧核糖核苷胸腺嘧啶残基。 5.22 阳性对照：已知受尼氏单孢子虫感染，且原位杂交结果显示阳性的贝类组织样本。 5.23 5.24 石蜡（熔点52℃~54℃）：切片级 5.25 甲酰胺。 5.26 丹哈特液(Denhardt's)。 5.27 鲑精DNA。 5.28 硫酸葡聚糖。 5.29 山羊血清。 5.30 二甲基甲酰胺。 5.31 浓盐酸。 5.32 碱性磷酸酶偶联的DIG抗体（AP-抗DIG0.75U/μL，4℃）：生化试剂。 5.33 二甲苯。 5.34 中性树胶：生物染色用。 5.35 无水乙醇。 5.36 95%乙醇。 5.37 甲醛（37%）。 5.38 冰醋酸。 2