ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 40192—2021 刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法 Detection and identification of Colletotrichum Corda using real-time PCR 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40192—2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国乌鲁木齐 海关、中国检验检疫科学研究院。 本文件主要起草人：段维军、蔡磊、刘芳、李雪莲、王、赵鹏、郭立新、张慧丽、张永江、陈先锋。 GB/T 40192—2021 刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法 1范围 本文件描述了植物病原真菌刺盘孢属实时荧光PCR检疫鉴定方法。 本文件适用于携带刺盘孢属病菌的植物及其产品中刺盘孢属病菌的检测筛查。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 SN/T 2589 植物病原真菌检测规范 3 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 刺盘孢属的分类信息 中文名：刺盘孢属。 学名：Colletotrichum Corda。 根据《DictionaryoftheFungi》（第10版）（2008）分类系统，刺盘孢属隶属于真菌界（Fungi），子囊菌 门（Ascomycota），粪壳菌纲（Sordariomycetes），小丛壳目（Glomerellales），小丛壳科（Glomerellaceae）。 传播途径：刺盘孢属病菌主要由种子或病残体等传播，也可经风、雨水和昆虫传播， 5 鉴定原理 根据刺盘孢属病菌的DNA序列特征，采用实时荧光PCR方法，应用所设计引物和探针对刺盘孢 属病菌进行检测鉴定。 6 仪器设备、器具、试剂和培养基 6.1仪器设备和器具 高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅纯水仪、涡旋振荡器、紫外分光光度计、高速冷冻离心机、 冰箱、生化培养箱、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.1μL~2.5μL、1μL~10μL、10μL~50μL、20μL~ 200μL、100uL～1000uL）、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片 1 GB/T40192—2021 6.2试剂 次氯酸钠、液氮、超纯水、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)提取液（2%CTAB，1.4mol/LNaCl 20mmol/LEDTA，100mmol/LTris·HClpH8.0）、三羟甲基氨基甲烷（Tris)饱和酚、三氯甲烷、异戊 醇、异丙醇、70%乙醇、核糖核酸（RNA）酶、实时荧光聚合酶链式反应（Real-timePCR)反应预混液：2X Taq Man Universal PCR Master Mix。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：将200g马铃薯去皮，切小块，沸水煮20min后过滤，弃去滤渣， 在滤液中加人葡萄糖和琼脂粉各20g，加蒸馏水定容至1L。配成溶液后121℃下灭菌20min。 7检疫鉴定 7.1样品的采集与处理 样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。 7.2核酸的制备 采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)提取法，十六烷 基三甲基漠化铵（CTAB)提取法按照附录A的方法制备。 7.3DNA纯度与浓度的测定 用紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别读取260nm和280nm处的吸收值，计为 OD260、OD280。DNA的纯度OD260/ODz8比值应为1.7～1.9，DNA的浓度为50倍的OD260（μg/mL）。 DNA的浓度与纯度应符合实时荧光聚合酶链式反应（Real-timePCR）检测的要求 7.4实时荧光PCR检测 实时荧光PCR按照附录B的方法检测。 8结果判定 以疑似分离物或样品的实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据。 疑似分离物：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性；无典型扩增曲线判定为 阴性。 样品检测：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线，且Ct值≤35，判定为阳性：35≤Ct值≤40， 增加DNA用量2倍～10倍后再次测试，出现典型扩增曲线，且Ct值≤35，判定为阳性；其余情况判定 为阴性。 9样品保存、记录与复核 9.1样品保存、记录 植物源样品应置于2℃～8℃冰箱妥善保存，对检出刺盘孢属病菌的样品应至少保存6个月，以备 2