ICS 65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 40447—2021 鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Rathayibacter rathayi (Smith)Zgurskaya et al 2021-08-20发布 2022-03-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40447—2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位：浙江省检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国杭州海关、浙江大学、中国计量 大学。 本文件主要起草人：吴志毅、李可、任琰、黄凌哲、李斌、张蓬军、田红伟、程帆、方文渊、吴颖、陈鹏程。 GB/T 40447—2021 鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定方法 1范围 本文件描述了鸭茅蜜穗病菌的症状观察、分离培养及分子生物学等检疫鉴定方法 本文件适用于鸭茅草、黑麦、黑麦草、小麦等种子和植株上鸭茅蜜穗病菌的检疫鉴定， 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 SAC 4病菌基本信息 中文名：鸭茅蜜穗病菌 学名：Rathayibacter rathayi(Smith 1913)Zgurskaya et al.1993 异名:Clavibacter rathayi(Smith 1913) Davis et al.1984;Pseudobacterium rathayi(Smith 1913) Krasil'nikov 1949;Agrobacterium rathayi (Smith 1913) Savulescu 1947; Corynebacterium rathayi (Smith 1913)Dowson 1942;Erwinia rathayi (Smith 1913) Gram et al.1929;Phytomonas rathayi (Smith 1913)Bergey et al.1923;Bacterium rathayi（Smith 1913)Aujeszky1914;Aplanobacter rathayi Smith 1913. 分类地位：病菌属细菌域Bacteria，放线菌门Actinobacteria，放线菌纲Actinobacteria，放线菌目 Actinomycetales，微杆菌科Microbacteriaceae，拉氏杆菌属Rathayibacter。 鸭茅蜜穗病菌的其他基本信息参见附录A。 5 方法原理 根据鸭茅蜜穗病菌的为害症状，培养性状和生理生化特性对病原菌进行分离培养及致病性测试，根 据鸭茅蜜穗病菌的特异性DNA序列进行分子生物学检测。 6 仪器设备 超净工作台、高压灭菌锅、显微镜、培养箱、电子天平、离心机、冰箱、实时荧光PCR仪，BIOLOG微 生物鉴定系统等。 1 GB/T 40447—2021 主要试剂 70%乙醇，1%次氯酸钠，生理盐水，3%氢氧化钾（KOH)。 BHI、BHIA和D2NAX培养基配方按照附录B执行。 实时荧光PCR检测试剂按照附录 C的 C.1、C.2执行。 8检疫鉴定流程 检测样品的鸭茅蜜穗病菌检疫鉴定步骤按图1进行。 检测样品 初检 实时荧光PCR 阴性 阳性 无凝疑似菌落 病菌分离 凝似菌落 阴性 实时荧光PCR 阳性 阴性 生理牛化鉴定 阳性 阴性 致病性测试 附性 检出 未检出 检疫鉴定流程图 9检疫鉴定方法 9.1现场检疫 现场检疫中，如植株样品发现疑似症状（参见A.4），取样带回实验室作进一步显微镜检查和病菌分 离鉴定。种子样品进行隔离种植观察或病菌直接分离鉴定。取样方法按照SN/T2122执行。 9.2病菌分离 9.2.1种子浸提液制备 取种子样品100g，置于1%次氯酸钠溶液中表面消毒10min无菌水洗涤3次后加入200mL无菌 生理盐水，4℃冰箱浸泡过夜；纱布过滤，滤液14000g离心20min，1mL无菌水悬浮沉淀，制成种子 浸出液。可取部分浸出液离心沉淀提取DNA进行PCR初检，部分浸出液用于分离培养。 2