ICS07.080 CCS C 27 中华人民共和国国家标准 GB/T41907—2022 肠激酶活性检测方法 Assaymethod of enterokinaseactivity 2022-10-12实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41907—2022 目 次 前言 引言 11 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4 试剂或材料 5 仪器设备 6 试验步骤 结果计算 7 质量控制 8 GB/T41907—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由全国工具酶标准化工作组（SAC/SWG11）提出并归口。 本文件起草单位：雷谷（厦门）生物医药有限公司、通用生物系统（安徽）有限公司、苏州坤琪生物科 坊诺道中科医学检验实验室有限公司、福建南生科技有限公司、上海鹰姿生命科技有限公司、苏州海狸 生物医学工程有限公司、安琪酵母股份有限公司、山东大学、福建农林大学、复旦大学、上海楚豫生物科 技有限公司、中国计量科学研究院计量与分析科学研究所、深圳华大生命科学研究院。 本文件主要起草人：黄发灿、郑登忠、雍金贵、赵毅、张志刚、江锋、胖铁良、朱力、钟江、姚鹃、刘斌、 陈秀兰、任辉、邢志刚、赵超、全灿、曾峰、章文蔚、董宇亮、席凤、程磊 GB/T41907—2022 引言 内切割含有4个天冬氨酸的赖氨酸羧基端肽键（天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸）的蛋 白质水解酶。制定肠激酶活性检测方法的国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于肠激酶的生产 和使用具有重要意义。 GB/T41907—2022 肠激酶活性检测方法 1范围 本文件描述了肠激酶活性检测方法的试剂或材料、仪器设备、试验步骤、结果计算和质量控制。 本文件适用于肠激酶活性的检测 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682 2分析实验室用水规格和实验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 肠激酶enterokinase 十二指肠细胞分泌的一种可以切割含有4个天冬氨酸的赖氨酸羧基端肽键（天冬氨酸-天冬氨酸 天冬氨酸-天冬氨酸-赖氨酸）的蛋白质水解酶。 3.2 肠激酶活性单位（U) )activity unit of enterokinase 37℃，16h内将0.5mg的硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27），95%降解为NP-27所需要的 酶量为1个肠激酶活性单位（U）。 4试剂或材料 除非另有规定，本方法所用的试剂应为分析纯试剂，所有试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经 高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用0.22um过滤器过滤除菌：水为GB/T6682规定的一级水 4.1石 硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27）。 4.2 盐酸（HCI）：量取盐酸（12mol/L）适量，加入等体积的纯化水，配制成浓度为6mol/L。 4.3 氯化钠（NaCI）：固体 4.4 氯化钙（CaClz）：固体 4.5 反应缓冲液：50mmol/LTris-HCl.pH8.0（22℃），1mmol/LCaClz，0.1%Tween-20 4.6硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27）溶液：称取硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27）约 4.7肠激酶溶液：称取肠激酶适量，用反应缓冲液溶解并配制成每毫升含1mg蛋白的溶液，再稀释成 每毫升含0.1mg蛋白的溶液 1 GB/T41907—2022 32×SDS凝胶加样缓冲液：量取或称取10mL1mol/LTris-HCl,pH6.8,10mLβ-巯基乙醇，4g 4.8 SDS，0.2g溴酚蓝，20mL甘油，加水定容至100mL。 5 仪器设备 紫外分光光度计、恒温培养箱、电泳仪、电泳槽、电子分析天平（感量：0.0001g）。 6 试验步骤 6.1酶切反应 取离心管8支，各加人硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27）溶液40μL，再依次分别加人肠激酶 溶液0μ2μ3μ、4μ、5μL、6μ、7.8μ.再依次分别加入反应缓冲液10μL8μ、7μL、 6μL、5uL、4μL、3uL、2uL，置于37℃±0.5℃水浴中，反应16h后，各加人50L的2×SDS凝胶加 样缓冲液终止酶切反应，分别取各反应液20μL，进行SDS-PAGE凝胶电泳。 6.2 2电泳 12%SDS-PAGE凝胶电泳，电压90V120V，当溴酚蓝线到达凝胶板底部时停止电泳，取出凝胶 进行染色30min，并过夜脱色至无底色。当融合蛋白电泳条带看不见时，表明此时的肠激酶量恰好能 将该融合蛋白样品完全酶切，并以此反应体系作为依据计算酶活性。 1 结果计算 供试品中肠激酶活性按公式（1）计算： 2c,V C2V2 式中： S 一肠激酶活性，单位为肠激酶活性单位每毫克蛋白或固含物（U/mg）； Thioredoxin-NP-27浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C1: V——Thioredoxin-NP-27加人量，单位为微升（μL)； 肠激酶浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C2 V2—肠激酶加入量，单位为微升（μL）。 8质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。 2 GB/T41907—2022 32×SDS凝胶加样缓冲液：量取或称取10mL1mol/LTris-HCl,pH6.8,10mLβ-巯基乙醇，4g 4.8 SDS，0.2g溴酚蓝，20mL甘油，加水定容至100mL。 5 仪器设备 紫外分光光度计、恒温培养箱、电泳仪、电泳槽、电子分析天平（感量：0.0001g）。 6 试验步骤 6.1酶切反应 取离心管8支，各加人硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27）溶液40μL，再依次分别加人肠激酶 溶液0μ2μ3μ、4μ、5μL、6μ、7.8μ.再依次分别加入反应缓冲液10μL8μ、7μL、 6μL、5uL、4μL、3uL、2uL，置于37℃±0.5℃水浴中，反应16h后，各加人50L的2×SDS凝胶加 样缓冲液终止酶切反应，分别取各反应液20μL，进行SDS-PAGE凝胶电泳。 6.2 2电泳 12%SDS-PAGE凝胶电泳，电压90V120V，当溴酚蓝线到达凝胶板底部时停止电泳，取出凝胶 进行染色30min，并过夜脱色至无底色。当融合蛋白电泳条带看不见时，表明此时的肠激酶量恰好能 将该融合蛋白样品完全酶切，并以此反应体系作为依据计算酶活性。 1 结果计算 供试品中肠激酶活性按公式（1）计算： 2c,V C2V2 式中： S 一肠激酶活性，单位为肠激酶活性单位每毫克蛋白或固含物（U/mg）； Thioredoxin-NP-27浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C1: V——Thioredoxin-NP-27加人量，单位为微升（μL)； 肠激酶浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C2 V2—肠激酶加入量，单位为微升（μL）。 8质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。 2 GB/T41907—2022 32×SDS凝胶加样缓冲液：量取或称取10mL1mol/LTris-HCl,pH6.8,10mLβ-巯基乙醇，4g 4.8 SDS，0.2g溴酚蓝，20mL甘油，加水定容至100mL。 5 仪器设备 紫外分光光度计、恒温培养箱、电泳仪、电泳槽、电子分析天平（感量：0.0001g）。 6 试验步骤 6.1酶切反应 取离心管8支，各加人硫氧还蛋白-NP-27（Thioredoxin-NP-27）溶液40μL，再依次分别加人肠激酶 溶液0μ2μ3μ、4μ、5μL、6μ、7.8μ.再依次分别加入反应缓冲液10μL8μ、7μL、 6μL、5uL、4μL、3uL、2uL，置于37℃±0.5℃水浴中，反应16h后，各加人50L的2×SDS凝胶加 样缓冲液终止酶切反应，分别取各反应液20μL，进行SDS-PAGE凝胶电泳。 6.2 2电泳 12%SDS-PAGE凝胶电泳，电压90V120V，当溴酚蓝线到达凝胶板底部时停止电泳，取出凝胶 进行染色30min，并过夜脱色至无底色。当融合蛋白电泳条带看不见时，表明此时的肠激酶量恰好能 将该融合蛋白样品完全酶切，并以此反应体系作为依据计算酶活性。 1 结果计算 供试品中肠激酶活性按公式（1）计算： 2c,V C2V2 式中： S 一肠激酶活性，单位为肠激酶活性单位每毫克蛋白或固含物（U/mg）； Thioredoxin-NP-27浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C1: V——Thioredoxin-NP-27加人量，单位为微升（μL)； 肠激酶浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）； C2 V2—肠激酶加入量，单位为微升（μL）。 8质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的10%。 2 GB/T41907—2022 32×SDS凝胶加样缓冲液：量取或称取10mL1mol/LTris-HCl,pH6.8,10mLβ-巯基乙醇，4g 4.8 SDS，0.2g溴酚蓝，20mL甘油，加水定容至100mL。 5 仪器设备 紫外分光光度计、恒温培养箱、电泳仪、电泳槽、电子分析天平（感量：0.000