ICS65.080 CCS B 10 中华人民共和国国家标准 GB/T41728—2022 微生物肥料质量安全评价通用准则 General criteria for quality and safety evaluation of microbial fertilizer 2023-05-01实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41728—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国石油和化学工业联合会提出。 本文件由全国肥料和土壤调理剂标准化技术委员会（SAC/TC105）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所。 本文件主要起草人：姜昕、马鸣超、李俊、曹凤明、关大伟、李力、陈慧君、葛一凡、杨小红、朱玲玲 冯瑞华、刘孝颖、季洪伟、贾聪。 1 GB/T41728—2022 微生物肥料质量安全评价通用准则 1范围 评价。 本文件适用于微生物肥料的质量安全评价。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB15193.3 食品安全国家标准急性经口毒性试验 GB 20287 农用微生物菌剂 GB38400 肥料中有毒有害物质的限量要求 NY/T 798 复合微生物肥料 NY/T 884 生物有机肥 NY/T 1113 微生物肥料术语 NY/T 1736 微生物肥料菌种鉴定技术规范 NY/T2066 微生物肥料生产菌株的鉴别 聚合酶链式反应（PCR）法 NY/T3083 农用微生物浓缩制剂 3 3术语和定义 NY/T1113界定的以及下列术语和定义适用于本文件。 3.1 微生物肥料 microbialfertilizer;biofertilizer 含有特定微生物活体的制品，应用于农业生产，通过其中所含微生物的生命活动，增加植物养分的 供应量或促进植物生长，提高产量，改善农产品品质及农业生态环境。 ［来源：NY/T1113—2006,2.1] 3.2 产品质量安全评价 qualityand safety evaluationfor product 对产品的质量属性和安全性进行分析、测定和评估，以判定其是否符合特定要求的过程 3.3 受试物 testsubstances 被测试的单一成分或混合物。 ［来源：GB15193.21—2014，2.1] 1 GB/T41728—2022 3.4 急性经口毒性 acuteoraltoxicity 一次或在24h内多次经口给予实验动物受试物后，动物在短期内出现的毒性效应， ［来源：GB15193.3—2014，2.1］ 3.5 半数致死量 medianlethaldose LDs0 经口一次或24h内多次给予受试物后，能够引起动物死亡率为50%的受试物剂量，该剂量为经过 统计得出的计算值。其单位是每千克体重所摄人受试物质的毫克数或克数，即mg/kg或g/kg。 来源：GB15193.3一2014，2.2，有修改 4通用要求 4.1用于评价的微生物肥料其产品质量应符合GB20287、NY/T884、NY/T798、NY/T3083等相应 产品标准，且其有毒有害物质应符合GB38400的限量要求 4.2微生物肥料生产用菌种依据其安全级别分为四级管理，菌种安全分级目录依据附录A；未列入附 录A中的菌种，除根瘤菌外，其余均应做毒理学试验。所有生产用细菌菌种均应做溶血试验，植物病原 菌不应用作生产菌种。如采用生物工程菌，应具有允许大面积释放的生物安全性有关批文。 4.3生产用菌株可通过分析其基因组中是否存在毒素、溶血素、抗生素等具安全风险的基因及基因簇 结构，评估其安全风险 4.4考虑到微生物肥料生产原料和功能菌吸附载体复杂多样，所有微生物肥料产品均采用急性经口毒 性试验进行其安全评价。 5菌种安全性分级 按微生物肥料生产用菌种的安全风险程度及其毒理学试验评价要求，将菌种安全性分为四级。 第一级（见A.1）为免做毒理学试验的菌种 第二级（见A.2）为应做急性经口毒性试验的菌种。 第三级（见A.3）为应做致病性试验的菌种 一第四级（见A.4)为禁用菌种。 6评价程序 6.1菌种评价程序 6.1.1应依据NY/T1736、NY/T2066等提供微生物肥料生产用菌种的鉴定报告，包括属及种的拉丁 学名和中文译名、形态、生理生化特性及鉴定依据、功能评价等信息。 6.1.2根据菌种的鉴定信息，按照附录A的规定，确定菌种安全级别以及需要做的毒理学试验和毒理 学检测项目 6.1.3对于需做毒理学试验的菌种，生产者需提供试验用纯菌种，经复核确认与该菌种鉴定资料相符 且无杂菌污染后，进行毒理学试验。 2 GB/T41728—2022 6.2 2产品评价程序 在对待评价产品进行质量检测和载体物料的真实性确认后，进行毒理学试验。 7试验方法 7.1 受试物的准备 7.1.1菌种受试物 将试验菌种接种于适宜的培养基中，在适宜的条件下培养一定时间，用生理盐水调整菌液浓度至 2.0X108CFU/mL~2.0×109CFU/mL，该菌悬液为菌种受试物。 7.1.2 产品受试物 固体产品根据试验要求，配制所需浓度，溶剂首选去离子水，也可选用羧甲基纤维素、明胶、淀粉等。 液体产品不可稀释，直接使用。 7.2 2急性经口毒性试验 按GB15193.3的规定执行。 7.3 3致病性试验项目 7.3.1急性经口毒性试验 同7.2。 7.3.2 一次破损皮肤刺激试验 按附录B的规定执行。 7.3.3 溶血试验 7.3.3.1i 试剂或材料 7.3.3.1.1 血琼脂平板。 7.3.3.1.2 质控菌株：金黄色葡萄球菌ATCC6538、蜡样芽孢杆菌CMCC（B)63303等。 7.3.3.2 仪器设备 7.3.3.2.1 实验室常用仪器。 7.3.3.2.2 培养箱。 7.3.3.3 3操作步骤 2)h后观察有无溶血环产生。同时，用已知阳性菌株金黄色葡萄球菌ATCC6538、蜡样芽孢杆菌CMCC （B)63303等作为质控菌株 7.3.3.4评价要求 菌落周围有β溶血环或α溶血环的，则溶血试验阳性；否则为阴性。 3 GB/T41728—2022 7.3.4抗菌药物敏感试验 7.3.4.1试剂或材料 7.3.4.1.1抗菌药物：可选用头孢唑啉（CZ）、头孢哌酮（CFP）、四环素（TE）、强力霉素（DO）、氨苄青霉 素（AM）、丁胺卡那霉素（AN）、环丙沙星（CIP）、链霉素（S）、复方新诺明（SXT）、庆大霉素（GM）、氯霉 素（C）、克林霉素（CLN）、万古霉素（VAN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、黄连素（BerberineHydro- chloride）、两性霉素B(AMB）、氟康唑（FLU）、伊曲康唑（ITC）、益康唑（ECN）、咪康唑（MCL）、酮康唑 （KCA）、克霉唑（CLO）、制霉菌素（NY）等抗菌药物 7.3.4.1.2质控菌株：大肠埃希氏菌ATCC25922、酿酒酵母ATCC9763等标准菌株。 7.3.4.21 仪器设备 7.3.4.2.1 实验室常用仪器。 7.3.4.2.2培养箱。 7.3.4.3操作步骤 7.3.4.3.1 用无菌棉拭子将受试物均匀涂抹于适宜培养基平板表面，共3次。每涂抹1次，平板应转动 60°，最后将棉拭子绕平板边缘涂抹1周。盖好平皿，置室温干燥5min。 7.3.4.3.2用无菌棉拭子蘸取浓度为2.0×108CFU/mL~2.0X10°CFU/mL质控菌株菌悬液，均勾涂 抹于适宜培养基平板表面，具体方法同7.3.4.3.1，作为对照试验。 7.3.4.3.3以无菌操作取出抗菌药物纸片分别贴在涂有受试物和质控菌株菌悬液的平板培养基表 面，每个平板放4个～6个纸片。然后将平板置于适宜温度下培养，18h～72h后观察抗菌药物纸片周 均值。 7.3.4.3.4质控菌抑菌环应均在质控范围内，说明试验方法准确可靠，否则试验无效。质控菌株可选用 7.3.4.4评价要求 抗菌药物纸片周围有抑菌圈的，则药物敏感；否则为耐药， 7.3.5急性腹腔注射致病性试验 7.3.5.1 实验动物 清洁级健康成年昆明小鼠（Kunmingmice）或BALB/c小鼠（BALB/cmice）。 7.3.5.2操作步骤 选健康成年小鼠40只，体重18g~20g，雌、雄各半，剂量为500mg/kg，按0.1mL/10g经腹腔注 射受试物。 于腹腔注射后第3天、第7天分别取存活的实验动物雌、雄各5只解剖，并做大体病理学观察和病 理组织学检查。 腹腔注射后第14天将剩余实验动物处死、解剖并做大体病理学观察和病理组织学检查。 4 GB/T41728—2022 7.3.5.3结果观察和评价 根据试验周期内动物有无死亡及出现的中毒体征、大体病理学观察及病理组织学检查发现病变的 程度进行分级判定（见表1）。 表1急性致病性判定要求 级别 判定依据 动物出现死亡，死亡动物及24h以上存活动物在第3天、第7天经解剖肉眼检查和病理组织 强致病性 学检查即可发现脏器的明显病变 动物有中毒体征无死亡，动物第14天经解剖肉眼检查和病理组织学检查可发现脏器的明显 弱致病性 病变 动物无中毒体征无死亡，动物第14天经解剖肉眼检查和病理组织学检查均未发现脏器的明显 无致病性 病变 7.3.6 急性眼刺激试验 按附录C的规定执行。 8 结果评价 8.1 总体要求 凡按附录D