ICS07.080 CCS C 27 中华人民共和国国家标准 GB/T41712—2022 脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质检测方法 Assay method of deoxyribonuclease I activity and impurity 2023-05-01实施 2022-10-12发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 41712—2022 目 次 前言 II 引言 IV 1 范围 2 规范性引用文件 3术语和定义 试剂或材料 4 5 仪器设备 试验步骤 6 质量控制 GB/T41712—2022 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任， 本文件由全国工具酶标准化工作组（SAC/SWG11）提出并归口。 本文件起草单位：福建南生科技有限公司、夏禾（深圳）生物技术有限公司、深圳市中鼎检测技术有 限公司、苏州坤琪生物科技有限公司、埠产品质量监督检验研究院、南京诺唯赞生物科技股份有限公 生物医药有限公司、北京中天标科标准化技术研究院有限公司、复旦大学、厦门致善生物科技股份有限 公司、山东大学、安琪酵母股份有限公司、上海楚豫生物科技有限公司、武汉科技大学、中国计量科学研 究院计量与分析科学研究所、厦门艾德生物医药科技股份有限公司。 本文件主要起草人：黄发灿、郑登忠、阙广磊、赵毅、郭庆、王翠、周高怀、钟江、朱力、陈秀兰、姚鹃、 宋娜杰、全灿、许文来、邢志刚、杨忠华、李超。 I GB/T41712—2022 引言 脱氧核糖核酸酶I（DNaseI,EC3.1.21.1)是最有代表性的核酸内切酶，降解单链和双链DNA，产 生具有5-磷酸末端的分解物，在一般条件下其分解产物含有单核苷酸或8个～12个碱基的寡核苷 酸，平均大小约4个核苷酸。制定脱氧核糖核酸酶I国家标准，用以推动该类工具酶的产业化，对于脱 氧核糖核酸酶I的生产和使用具有重要意义。 IV GB/T41712—2022 脱氧核糖核酸酶工酶活及杂质检测方法 1范围 本文件描述了脱氧核糖核酸酶工酶活及杂质的检测方法 本文件适用于脱氧核糖核酸酶I酶活及杂质的检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 GB/T6682 2分析实验室用水规格和实验方法 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 脱氧核糖核酸酶 deoxyribonuclease 水解脱氧核糖核酸（DNA）中磷酸二酯键，生成寡核苷酸或单核苷酸的核酸酶。 3.2 脱氧核糖核酸酶I deoxyribonuclease I 水解单链和双链DNA，产生具有5'-磷酸末端的单核苷酸或寡核苷酸（8个～12个碱基）的核酸内 切酶。 3.3 脱氧核糖核酸酶I活力单位 activityunitofdeoxyribonucleaseI 以小牛胸腺DNA为底物，在25℃、pH5.0的溶液中.在260nm处每毫升每分钟变化0.001吸光 度值为一个酶活性单位（kunitzunit）。 3.4 杂质impurity 影响底物的其他核酸内切酶或核酸外切酶。 4试剂或材料 4.1水 符合GB/T6882规定的二级水。 4.2 21mol/L醋酸钠缓冲液 精密称取8.2g无水乙酸钠，溶于水中，用5mol/LHCl，调至pH5.0，混匀后，定容至100mL。 1 GB/T41712—2022 4.3 30.1mol/L硫酸镁溶液 精密称取1.2g无水硫酸镁，溶于水中，混勾后，定容至100mL。 4.4 0.85%氯化钠溶液 精密称取0.85g氯化钠，溶于水中，混匀后，定容至100mL。 4.5 5小牛胸腺DNA溶液 精密称取33mg小牛胸腺DNA，用冷水定容至100mL，置4℃过夜溶解。 4.6 0.1%酵母RNA溶液 精密称取0.1g酵母RNA，用0.1mol/L醋酸钠缓冲液溶解并定容至100mL。 4.7 供试品 取固体或液体待测供试品适量，用冷的0.85%氯化钠溶液溶解并稀释。 5 仪器设备 紫外-可见分光光度计、pH计、微量进样器、恒温水浴锅、电子天平、电泳仪、分析天平（万分之一）。 6 试验步骤 6.1酉 酶活性检测 6.1.1底物溶液 按表1配制底物溶液并进行标定：用0.85%氯化钠溶液作空白对照清零，取底物溶液2.5mL，加入 0.5mL0.85%氯化钠溶液，混匀后在紫外分光光度计中测定波长260nm处的吸光度值A260应为 0.60士0.05，否则应调整小牛胸腺DNA的加样量 表1底物溶液的配制 试剂 体积/mL 1mol/L醋酸钠缓冲液 5.0 0.1mol/L硫酸镁溶液 2.5 小牛胸腺DNA溶液 6.0 纯化水 36.5 总体积 50.0 6.1.2酶促反应（25℃） 按表2配制酶促反应液，混匀后立即置紫外分光光度计中测波长260nm处的吸光度值A260，每分 钟读数一次，共计3次，取相邻两个读数差值△A260/min的最大值。△A260/min的最大值应在0.067~ 2 GB/T41712—2022 0.083之间，否则需调整供试品的稀释度 表2 酶促反应配制表 试剂 供试品/mL 对照品/mL 底物溶液 2.5 2.5 供试品 0,5 0.85%氯化钠溶液 0.5 总体积 3.0 3.0 6.1.3 酶活性计算 6.1.3.1 单位体积中酶活性按式（1）计算。 A.×3Xdr Upv (1) 0.001X0.5 式中： UDv 酶活性每单位体积，单位为酶活性单位每毫升（kunitzunit/mL）： Ad AA260/min的最大值； 3 酶促反应液的总体积，单位为毫升（mL）； 0.5 酶促反应液中供试品的加样量，单位为毫升（mL）； dr 稀释倍数； 0.001 260nm处每毫升每分钟变化0.001吸光度值。 6.1.3.2 单位固体质量中酶活性按式（2）计算。 Upv sn ·(2) Cd 式中： Ups——酶活性每单位质量，单位为酶活性单位每毫克（kunitzunit/mg）； UDv 一酶活性每单位体积，单位为酶活性单位每毫升（kunitzunit/mlL）； Ca 供试品的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。 6.2RNase杂质检测 6.2.1 溶液配制 6.2.1.1 溶液1:13.61g三水合乙酸钠、800mL纯化水，用2mol/L乙酸调pH5.0，定容至1L。 6.2.1.2 溶液2：0.1g酵母RNA、100mL溶液1，溶解30min。 6.2.2 供试品溶液 6.2.2.1 溶液E：取固体/液体待测供试品适量，用冰预冷的纯化水溶解并稀释。 6.2.2.2 溶液E。：将溶液E，稀释2倍。 6.2.3RNase活性检测 6.2.3.1 水解速率测试（E。） 用纯化水作空白对照，按表3配制水解速率测试反应液，混匀后立即在25℃条件下在线检测，每分 3 GB/T41712—2022 钟读数一次，即为E。值，共计10min。 表3 水解速率测试（E。）反应液配制表 试剂 测试1/ml 测试2/mL 测试3/mL 空白/ml 溶液2 1.50 1.50 1,50 纯化水 1.30 1.35 1.40 3.00 溶液E。 0.20 0.15 0.10 总体积 3.00 3.00 3.00 3.00 6.2.3.2 总水解度测试（E，） 用纯化水作空白对照，按表4配制总水解度测试反应液，混勾后立即在25℃条件下在线检测，每分 钟读数一次，共计20min，E，值为△A300/min≤0.002时的读数。 表4总水解度测试（E）反应液配制表 试剂 测试/mL 空白/mL 溶液2 1.50 溶液E 1.50 纯化水 3.00 总体积 3.00 3.00 6.2.3.3 ln(E。一Er)与时间的直线斜率按式（3)计算。 AIn(E-E,) S= (3) At 式中： S 每分钟（E。一E,)对数直线斜率； E。 水解速率测试值； Er 总水解度测试值； At 反应时间10min。 6.2.3.4 RNase活性按式（4）计算。 SX3Xdr URs= ..(4) V。XCd 式中： URs RNase活性每单位质量，单位为酶活性单位每毫克（kunitzunit/mg）； s 每分钟（E。一E)对数直线斜率； 3 反应液的总体积，单位为毫升（mL）； de 稀释倍数； Vo 速率测试（E。）中酶的加样体积，单位为毫升（mL）； Cd 供试品的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。 6.2.4 RNase杂质含量按式（5）计算。 4 GB/T41712—2022 URs ×100% RNase% Ups 式中： Urs——供试品中RNase活性，单位为酶活性单位每毫克（kunitzunit/mg）； Urs供试品中DNasel活性，单位为酶活性单位每毫克（kunitzunit/mg）。 7 质量控制 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值 的10%。