ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T41556—2022 牛巴贝斯虫病诊断技术 Diagnostic techniques for bovine Babesia infection 2023-02-01实施 2022-07-11发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T41556—2022 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由中华人民共和国农业农村部提出。 本文件由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所 本文件主要起草人：殷宏、关贵全、刘爱红、刘军龙、罗建勋。 1 GB/T41556—2022 牛巴贝斯虫病诊断技术 1范围 本文件规定了牛巴贝斯虫（Babesiabouis）和双芽巴贝斯虫（Babesiabigemina）的检测技术及牛巴 贝斯虫病的诊断技术要求 本文件适用于牛巴贝斯虫病病原检测、核酸检测、抗体检测及牛巴贝斯虫病的诊断。 注：本文件所称牛巴贝斯虫病为牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫单独或混合感染引起的牛的巴贝斯虫病。 2规范性引用文件 2 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27401实验室质量控制规范 动物检疫 3 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphosphate） EB：溴化乙锭（Ethidiumbromide） ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay） HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase） IgG：免疫球蛋白G（ImmunoglobulinG） IPTG：异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside） ITS：内转录间隔区（Internaltranscribedspacer） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline） PBST：磷酸盐吐温缓冲液（PhosphatebufferedsalineTween） PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction） RAP-1：棒状体相关蛋白-1（Rhoptryassociatedprotein-1) TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Tris-acetate-EDTA） TMB：33'5,5'-四甲基联苯胺（3.3,5,5-Tetramethylbenzidine） 1 GB/T41556—2022 5材料和试剂 5.1试剂 5.1.1 除特别规定外，在检测中使用的试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682的要求。 5.1.2 姬姆萨染色液原液，按照附录A中A.1方法配制 5.1.3 姬姆萨染色液工作液，按照A.2方法配制。 5.1.4 甲醇。 5.1.5 香柏油。 5.1.6 2×PremixTag酶混合液（商品化）包含DNA聚合酶、缓冲液和2.5mmol/L的dNTP混合物 5.1.7 无RNase水。 5.1.8 全血基因组DNA提取试剂盒。 5.1.9 琼脂糖（电泳级）。 5.1.10 1XTAE缓冲液·按照A.3方法配制。 5.1.11 10mg/mL溴化乙锭（EB），按照A.4的方法配制，或同类核酸染料 5.1.12 牛巴贝斯虫阳性基因组对照（用牛巴贝斯虫感染牛，染虫率达到5%以上时，采集抗凝血，提取 血液基因组DNA，稀释至1ng/uL；或序列合成基因片段（见附录B中B.1)作为阳性对照。 5.1.13 双芽巴贝斯虫阳性基因组对照（用双芽巴贝斯虫感染牛，染虫率达到5%以上时，采集抗凝 血，提取血液基因组DNA，稀释至1ng/μL；或序列合成基因片段（见B.2)作为阳性对照。 5.1.14 巴贝斯虫阴性基因组对照（筛选巴贝斯虫阴性牛，提取血液基因组DNA，稀释至1ng/uL）。 5.1.15 核酸分子Marker。 5.1.16 辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗牛IgG抗体。 5.1.17 TMB底物溶液。 5.1.18 包被液、稀释液、封闭液、洗涤液和终止液，按照附录A的方法配制 5.2 耗材 5.2.1 载玻片。 5.2.2 抗凝真空采血管 5.2.3 剪毛剪。 5.2.4 1.5mL无菌离心管。 5.2.5 200μLPCR管。 5.2.6 各种规格的微量移液器吸头。 5.2.7 96孔ELISA板。 5.2.8 次性封板膜。 5.3 仪器 5.3.1 光学显微镜（含100×物镜）。 5.3.2 PCR扩增仪。 5.3.3 核酸电泳系统。 5.3.4 凝胶成像仪。 5.3.5 单道微量移液器（1μL~10μL;10μl~100μL;100μL~1000μL）。 5.3.6 8道或12道微量移液器（50μL~300μL）。 5.3.7 离心机。 2 GB/T41556—2022 5.3.8高压蒸汽灭菌器。 5.3.9酶标仪。 5.3.10 恒温箱。 5.3.11林 核酸蛋白检测仪。 6 生物安全要求 样品采集、处理及检测过程中涉及的实验操作，应遵守GB19489和GB/T27401的相关规定。 临床诊断 7.1 典型临床症状 7.1.1 体温升高到40℃~42℃，呈稽留热型。 7.1.2 贫血，可视黏膜苍白或黄染（见附录C图C.1中）。 7.1.3 血红蛋白尿，尿液呈棕红色至酱油色。 7.1.4 牛巴贝斯虫感染时，会表现较严重的神经症状。 7.2 典型病理变化 7.2.1 血液稀薄如水，凝固不良。 7.2.2 皮下组织、肌间结缔组织和脂肪呈胶样浸润黄染（见图C.1中②）。 7.2.3 皱胃和肠黏膜潮红并有点状出血 7.2.4 实质性脏器肿大、出血、黄染或呈深棕色（见图C.1中③）。 7.2.5 膀胱膨大，贮存尿液深棕色（见图C.1中）。 7.3流行特点 7.3.1 患病动物有蜱叮咬史，该病主要发生在微小扇头蜱（微小牛蜱）（见附录D中图D.1)分布的区域 7.3.2 一年之内可以暴发2～3次，多发生于4月～10月，呈散发。 7.3.3 两岁以内的特牛多发：本地牛症状轻微，引进牛、纯种牛和改良牛常表现明显临床症状 7.4 4结果判定 牛只出现7.1临床症状或剖检时有7.2病理变化，并符合7.3的流行特点，判为疑似牛巴贝斯虫病。 8血涂片显微镜镜检 8.1血涂片制备 用剪毛剪剪去牛耳尖牛毛，针头刺破耳尖，挤取一滴耳尖静脉血于载玻片上，用推片将血液推成薄 血涂片，并迅速晾干。 8.2血涂片固定 加甲醇于血涂片上进行固定，使甲醇完全覆盖血涂层，待晾干后重复一次。 8.3血涂片染色 在固定好的血涂片上滴加姬姆萨染色液工作液，使染色液完全覆盖血涂层。室温染色30min，用 3 GB/T41556—2022 自来水冲洗掉染色液，自然晾干或用吹风机吹干待检 8.4显微镜镜检 在染色好的血涂片上滴加一滴香柏油，用光学显微镜在100×物镜下观察100个视野 8.5结果判定 8.5.1阳性 红细胞内观察到巴贝斯虫典型虫体（见附录E中图E.1和图E.2)时，判为血涂片显微镜镜检阳性。 8.5.2疑似阳性 红细胞内未见典型虫体，但观察到少量点状、较大的圆形单个疑似虫体时，判为血涂片显微镜镜检 疑似阳性。 8.5.3阴性 未出现8.5.1和8.5.2的结果，判为血涂片显微镜镜检阴性 9牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫PCR检测方法 9.1样品处理 采集牛静脉抗凝血于密闭塑料离心管中，编号，4℃保存，送检。 9.2 2DNA提取 用商品化的血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，方法按照试剂盒说明书。提取的 DNA立刻进行PCR扩增或一20℃保存备用。 9.3PCR反应操作方法 9.3.1反应体系 用引物BoF/BoR和BbF/BbR，按照附录F中表F.1引物序列合成。配制PCR反应体系，按照附 录G中表G.1配制，反应体系为25μL。牛巴贝斯虫阳性DNA为牛巴贝斯虫阳性基因组对照 （5.1.12），双芽巴贝斯虫阳性DNA为双芽巴贝斯虫基因组对照（5.1.13），阴性对照为巴贝斯虫阴性牛血 液基因组（5.1.14)。 9.3.2反应条件 于200μLPCR管中配制反应体系，混匀，置PCR仪中进行扩增。扩增程序为：95℃预变性5min； 然后92℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共扩增35个循环；72℃延伸10min。 9.3.3PCR产物琼脂糖凝胶电泳和成像 用1XTAE缓冲液配制1.5%琼脂糖凝胶，取PCR产物10μL与2μL6X加样缓冲液混合，加样于 含漠化乙锭或同类核酸染料的1.5%琼脂糖凝胶制备的凝胶块中。在1×TAE缓冲液中，5V/cm电泳 约30min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，凝胶成像分析系统观察结果，并拍照保存。 4 GB/T41556—2022 9.3.4质控标准 9.3.4.1牛巴贝斯虫特异性引物扩增 牛巴贝斯虫阳性DNA对照出现大小为408bp的特异性条带，且双芽巴贝斯虫阳性DNA和阴性 对照无扩增条带时，判为试验成立（按附录H中图H.