SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4613—2016 国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法 Real-time RT-PCR method for Kunjin virus detection at frontier ports 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4613—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、河北国际旅行卫生保健中心。 本标准主要起草人：孙肖红、刘键、闫冀焕、徐宝梁、马雪征、张丽萍、白红岩 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4613—2016 国境口岸昆津病毒荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了昆津病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理和荧光RT PCR检测。 本标准适用于昆津病毒的荧光RT-PCR检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发[2006】15号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 3.1 昆津病毒Kunjinvirus；KUNV 也可译为“库京病毒”，属于黄病毒科黄病毒属成员，于1960年在澳大利亚的环喙库蚊（Culexan nulirostris）中首次分离。除了环喙库蚊以外，伪杂鳞库蚊（Culerpseudovishnui）、致倦库蚊（Culer quinquefasciatus）、澳大利亚库蚊（Culeraustralicus）和鳞状库蚊（Culersuamosus）等也可传播该病 毒。病毒的主要宿主是鸟类、家禽、猪、牛、马。水鸟可以将病毒传播至远方，而猪、牛、马又可起到放大 宿主的作用。昆津病毒病是一种人畜共患病，主要流行于澳大利亚，人类感染后主要表现为发热、头痛、 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 FAM FAM荧光染料，一种荧光报告基团； RNA 核糖核酸； RT-PCR 反转录-聚合酶链反应。 生物安全要求 C 《人间传染的病原微生物名录》规定，昆津病毒的未经培养的感染性物质、灭活材料的操作应在不同 级别生物安全实验室进行，具体如下： 1 SN/T 4613—2016 昆津病毒相关的感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2或ABSL-2)实验室内进行； 昆津病毒相关的灭活材料在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行； 昆津病毒感染性材料运输包装分类为B类，UN编号为UN3373。 6标本的采集、运输和保存 6.1人血清标本 无菌采集可疑病人的静脉血3mL~5mL，室温静置30min，然后500g离心10min，收集上清（血 清）于2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，4℃以下送检。不能及时检测的标本应保存 于一70℃或以下温度。 6.2蚊虫 根据实际工作需要采集蚊虫样品。将采集的蚊虫直接放人一20℃冰箱冻死后，取出，分类编号，按 30只～50只一份，装入2mL螺口塑料管内，用耐低温油性记号笔记上编号，干冰或液氮运输，或 一70℃以下保存待检。 7标本的处理 7.1 人血清标本 血清标本可直接提取核酸。 7.2蚊虫 7.2.1从一70℃容器中取出蚊虫标本，倒人研磨器中。 7.2.2加人1mLPBS或生理盐水吹洗，弃去液体后加人1mLPBS或生理盐水，反复研磨至组织碎片 基本消失。 7.2.3将研磨液吸人1.5mL离心管，配平后置预冷4℃的离心机上，20000g离心10min 标准信息服务平台 7.2.4取上清液提取核酸。 8荧光RT-PCR检测 8.1主要仪器 需要以下仪器： 荧光定量PCR仪； 超净工作台； 生物安全柜； 高压灭菌锅； 低温高速离心机：最大离心力20000g； 漩涡振荡器； 冰箱：4℃、-20℃和-70℃； 移液器：10μL、20μL、100μL、200μL和1mL。 2