SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 27772011 输入性啮齿动物携带流行性出血热 病毒的巢式RT-PCR检测方法 Detection of epidemic hemorrhagic fever virus(EHFV) inimported rodents-Method of nestedRT-PCR 行业标准信息服务平台 2011-02-25发布 2011-07-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2777—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫 局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：郑剑宁、裘炯良、胡群、吴薇、黄彤文、杨苹、王燕。 行业标准信息服务平台 SN/T 2777—2011 输入性啮齿动物携带流行性出血热 病毒的巢式RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的生物安全要求、检测方法、结果的 报告、阳性结果处置。 本标准适用于出人境检验检疫机构对输入性啮齿动物携带流行性出血热病毒的检测，对口岸发现 的啮齿动物及食虫目动物中的普通、大麝、臭等检测流行性出血热病毒也可参照执行。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 啮齿动物rodents 哺乳纲中种类最多，分布最广的一类动物，包括啮齿目和免形目。一般体型较小，数量多，繁殖快， 适应力强，其中多数可携带流行性出血热病毒。 3.2 输入性啮齿动物importedrodents 通过入境交通工具、集装箱、货物、行李及邮包携带人境的啮齿动物 3.3 流行性出血热epidemichemorrhagicfever；EHF 由啮齿动物携带的汉坦病毒引起的伴有肾综合征的一类出血热的综合名称，主要包括姬鼠型及家 鼠型流行性出血热及流行性肾病。 3. 4 流行性出血热病毒epidemichemorrhagicfevervirus；EHFV 属布尼亚病毒科，汉坦病毒属，是一组单股负链RNA病毒，由大（L）、中（M）、小（S）3个片段组成 分别编码病毒的RNA依赖的RNA多聚酶（L）、外膜蛋白GI、G2和核衣壳蛋白（N），为流行性出血热 的病原体，常见有汉滩病毒型和汉城病毒型。 4生物安全要求 及实验台进行灭菌消毒，以保证实验室工作人员及实验室安全。 1 SN/T 2777—2011 5真 巢式RT-PCR 5.1器材与试剂 5.1.1器材 PCR扩增仪、电泳仪、微量移液器及吸头、电子分析天平、紫外观察灯、恒温培养箱、普通冰箱、超低温 冰箱（一80℃）、组织研磨器、外排式生物安全柜、液氮罐、离心机和离心管、常温摇床、PCR管、剪刀、镊子。 5.1.2试剂 5.1.2.1水 应符合GB/T6682中一级水的规格。用于PCR（包括核酸抽提）时所用的水应是无RNA酶的水。 5.1.2.2TaqDNA聚合酶 浓度为5U/μuL，一20℃保存。 5.1.2.3AMV逆转录酶 浓度为10U/μL，一20℃保存。 5.1.2.4RNase抑制剂(RNasin) -20℃保存。 5.1.2.5 dNTP 含dCTP、dGTP、dATP和dTTP,浓度均为10mmol/L 5. 1.2.620 μmol/L 引物 5. 1. 2. 6. 1 过 逆转录引物序列 5'-TAGTAGTAGACTCC-3 5.1.2.6.2通用外引物序列 5'-AAAGTAGGTGITA YATCYTIACAATGTGG-3 5'-GTACAICCTGTRCCIACCCC-3 5.1.2.6.3汉滩病毒引物序列 5-GAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC-3" 5-GGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC-3 5.1.2.6.4 汉城病毒引物序列 5-GTGGACTCTTCTTCTCATTATT-3" 5'-TGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG-3' 5.1.2.7无水乙醇 分析纯，无DNA酶和RNA酶.使用前预冷到一20℃。 2