SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4615—2016 国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时 荧光RT-PCR检测方法 Detection method for human infected avian influenza A (H7N9) virus by real time RT-PCR at frontier ports 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4615—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准草单位：中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：胡孔新、马雪征、张丽萍、孙肖红、刘健。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4615—2016 国境口岸人感染H7N9禽流感病毒实时 荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸人感染H7N9禽流感病毒检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存， 标本的处理，人感染H7N9禽流感实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于国境口岸人出境人员携带人感染H7N9禽流感病毒的核酸检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定（中华人民共和国卫生部令（第 45号）） 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 人感染H7N9禽流感病毒HumaninfectedavianinfluenzaA（H7N9） 正粘病毒科所属的禽流感病毒的一种亚型，该病毒为新型重配病毒。由于禽流感病毒与人流感病 毒存在受体特异性差异，虽然偶尔会有某些H7病毒（H7N2、H7N3、H7N7）感染人类的报告，一般认为 禽流感是不易感染给人的，但经过近年来流感病毒的基因重组，一些既往在禽间传播的高致病性禽流感 亚型和新形成的禽流感亚型已可以突破种系感染人类。 3.2 实时荧光RT-PCRrealtimefluorescenceRT-PCR 在常规RT-PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记 一个报告基团和一个率灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收：PCR扩 增时，利用Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监 测系统可以接受到荧光信号。每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，用Ct值 表示。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1 RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） 1 SN/T 4615—2016 4.2 Ct 值Cycle threshold 循环阈值，每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 4.3 FAM:6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein） 种荧光报告基团。 4.4 BHQ1：黑洞淬灭基团（BlackHoleQuencher1） 类非荧光淬灭基因。 5检测对象 出入境口岸发现的可疑病例。 6实验室生物安全要求 生物安全遵循以下要求： 个人防护遵循GB19489； 实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全二级（BSL-2)实验室的生物安全要求； 使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理； 疑似人感染H7N9禽流感病毒的材料的包装及转运应符合《可感染人类的高致病性病原微生 物菌（毒）种或样本运输管理规定》。 实验室仪器设备 本方法使用的主要仪器如下： 荧光PCR仪； 超净工作台； 二级生物安全柜； 高压灭菌锅； 漩涡振荡器； 冰箱：4℃、-20℃和-70℃； 移液器：10μL、20μL、100uL、200μL和1mI 恒温水浴锅； 无菌注射器。 8试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下： 标本保存液：pH7.4～7.6的Hanks液或Earles平衡盐溶液，并含5%牛血清白蛋白，万古霉 素100μg/mL,阿米卡星30μg/mL和制霉菌素40U/mL。商品化系统如BDUniversalViral CulturetteTM Transport System. 2