SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4055—2014 代替SN/T1635—2005 贝类中诺如病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实 时荧光RT-PCR方法 Detection method of norovirus in shellfish- Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4055—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T1635一2005《贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT PCR方法》。 本标准与SN/T1635一2005相比，主要技术变化如下： 一修改了标准的中文名称； 修改了病毒名称，即由诺沃克病毒修改为诺如病毒。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广西出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：刘军义、潘良文、李想、吕蓉、韦梅良、陈立军、罗兆飞。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1635—2005。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4055—2014 贝类中诺如病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实 时荧光RT-PCR方法 1范围 本标准规定了贝类中诺如病毒普通RT-PCR和实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于贝类中诺如病毒的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光RT-PCR real-timefluorescenceRT-PCR 实时荧光RT-PCR方法是在常规RT-PCR的基础上，加人了一条特异性的荧光探针。该探针为一 寡核苷酸，两端分别标记一个报告基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被 萍灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和萍灭荧光基团 分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧 光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 3.2 Ct 值 cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数， 4试剂 所有实验用试剂均为分析纯；除特别说明外，实验用水为蒸馏水或去离子水。 4.1诺如病毒阳性标本：由国家质量监督检验检疫总局指定单位提供。一80℃低温冰箱保存。 4.2 甘氨酸缓冲液：见A.1.1。 4.3PEG8000溶液：见A.1.2。 4.4 50XTAE缓冲液：见A.1.3。 4.5 溴化乙锭溶液（10μg/μL)：见A.1.4。 4.6 含0.5μg/mL溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶：见A.1.5。 4.7 10×加样缓冲液：见A.1.6。 1 SN/T 4055—2014 4.8 裂解液：Tri-reagent(Sigma公司，Cat.No.T-9424)或其他等效裂解液 4.9 Poly(dT)磁珠:Dynabeads-oligo(dT)z5(Cat.No.61005,Dynal Biotech Inc.,Oslo,Norway)或等 效品。 4.10 无RNase超纯水：见A.2.3。 4.11 75%乙醇：见A.2.4。 4.12 异丙醇：未开封的新品。 4.13 1XRNA吸附缓冲液：见A.2.5。 4.14 2XRNA吸附缓冲液：见A.2.6。 4.15 洗液：见A.2.7。 4.16 RNase抑制剂。 4.17 逆转录酶AMV。 4.18 DNA 聚合酶。 4.19 dNTPs:含dATP、dUTP、dCTP.dGTP各10mmol/L。 4.20 引物和探针：根据表1和表2的序列进行合成引物和探针，加无RNase超纯水配制成50μmol/L 储存液。 表1 普通RT-PCR检测的引物 引 物 检测的病毒类群 扩增片断大小/bp 正义引物JV12：5'-ATACCACTATGATGCAGATTA-3" GI 和 GII 327 反义引物JV13：5'-TCATCATCACCATAGAAAGAG-3” 表2实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 检测的病毒类群 引物和探针序列 扩增片断大小/bp 正义引物COG1F:5"-CGYTGGATGCGNTTYCATGA-3' 反义引物COG1R：5*-CTTAGACGCCATCATCATTYAC-3” GI 107 探针RING1(a)-TP:5'-FAM-AGATYGCGATCYCCTGTCCA-TAMRA-3' 探针RINGI(b)-TP:5-FAM-AGATCGCGGTCTCCTGTCCA-TAMRA-3' 正义引物COG2F:5°-CARGARBCNATGTTYGRTGGATGAG-3' GII 反义引物COG2R:5′-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3" 119 探针RING2-TP:5'-FAM-TGGGAGGGCGATCGCAATCT-TAMRA-3 注：引物COG1F、COG1RCOG2F，探针RING1(a)-TP为简并引物，序列中Y代表C或T,R代表A或G,B代 表A以外的其他3种碱基任何一个，N代表四种碱基中的任何一个 4.21 DNA分子量标记：100bp~2000bp。 仪器与器材 5.1 实时荧光PCR仪。 5.2 PCR仪。 5.3电泳仪。 5.4 凝胶分析成像系统。 2