SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3991—2014 赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Detection of akabane virus with real-time RT-PCR 行业标准信息服务平台 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3991—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：张吉红、唐泰山、黄素文、李如松、倪健波、王建峰、张常印。 行业标准信息服务平台 1 SN/T3991—2014 赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了赤羽病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本标准适用于家畜及其产品中赤羽病毒的检验。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适应于本文件。 3.1.1 实时荧光 RT-PCRrealtimeRT-PCR 在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RT-PCR扩增过程。 3.1.2 Ct 值 cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AKAV：赤羽病毒（Akabanevirius） DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethypyrocarbonate） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） 息服务平台 FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfiuorescein） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline） RNA：核糖核酸(RibonucleicAcid) SDS:十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate) TAMRA：6-羧基四甲基罗丹明（6-carboxytetramethylrhodamine） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase) 4仪器和设备 4.1荧光定量PCR核酸扩增仪。 1 SN/T 3991—2014 4.2 超净工作台。 4.3 电子天平。 4.47 高速冷冻离心机，台式小型离心机，微型离心机。 4.5 5冷藏冷冻冰箱。 4.6组织匀浆器。 4.7旋涡震荡器。 4.8微量移液器：2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。 4.9 一70℃低温冰箱。 4.10无RNase玻璃容器、无RNase离心管（1.5mL）、无RNase吸头（20μL、200μL、1000μL）、无 RNasePCR薄壁管、无RNase药匙：见A.4。 5试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试 剂均用无RNA酶污染的容器分装。 5.1裂解液：Trizol或其他等效裂解液。 5.2 2三氯甲烷：异戊醇：体积分数24：1。 5.3异丙醇：-20℃预冷。 5.4PBS(磷酸盐缓冲液）：见A.1。 5.5 无RNase水：见A.2。 5.6 75%乙醇：见A.3。 5.7 10XRT-PCR缓冲液。 5.8 ROX reference dye. 5.9 EX Taq HS。 5.10 RNase Inhibitor. 5.11 M-MLV RTase. 5.12引物和探针 引物和探针序列如下，其中探针的5'端标记FAM，3'端标记TAMRA。 上游引物 AKAV-1:5'-CCC CTG GTG CTG AGA TGT TT-3 下游引物AKAV-2:5'-CTT CCT CAT GAA GTT GACATCCAT-3' 信息服务平台 探针 AKAV probe:5'-ACC CAC TGG TTA TCG ACA TGC ACC G-3" 6样品的采集和前处理 6.1取样工具 6.1.1 棉拭子、剪刀、镊子、离心管。 6.1.2 所有上述取样工具应经121℃土2℃，15min高压灭菌并烘干 6.1.3采样方法 6.2活畜 用无菌注射器直接吸取血液至无菌离心管中，编号备用。 2