SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3954—2014 国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法 Detection of nipah virus at frontier port by RT-PCR and real time fluorescence RT-PCR 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3954—2014 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出入境检验检疫局、深圳市计量质量检测研究院、中华人民 共和国四川出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：莫秋华、李卫岗、谭华、史咏梅、胡科新、兰全学、林继灿、杨泽、赵俊华、陈肖萧、 行业标准信息服务平台 SN/T3954—2014 国境口岸尼帕病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸尼帕病毒RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法检验的对象、检测方法及 结果报告。 本标准适用于国境口岸尼帕病毒的实验室检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1193基因检验实验室技术要求 WS/T230临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构管理办法（原中华人民共和国卫生部） 人间传染的病原微生物名录（原中华人民共和国卫生部，2006年） 行业标准信 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 尼帕病毒Nipahvirus;Niv 尼巴病毒Nipahvirus;Niv 属于副粘病毒科（Paramyxoviridae）亨德拉尼帕病毒属（Henipauirus），单股负链RNA病毒，可引 起一种新型烈性人畜共患传染性疾病一一尼帕病毒病（Nipahvirusdisease，NVD），严重威胁人类和猪、 马等动物的健康。尼帕病毒感染人后的潜伏期为1周～3周，在人群中有人传人的可能，人的临床表现 主要为严重的快速进行性脑炎，脑干功能失常（表现为高血压、心动过速），死亡率高达40%～70%。不 同患者发病的严重程度各异，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，特征症状是颈部和腹部肌 肉挛，同时出现体温升高、头痛、嗜睡、呕吐、咳嗽、意识混乱，严重的昏迷、死亡。 3.2 逆转录聚合酶链反应reversetranscriptionpolymerasechainreaction；RT-PCR 将RNA的逆转录（RT)和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。本标准采用一步法逆 转录聚合酶链式反应（RT-PCR）。在一步法RT-PCR中，首先以RNA为模板，利用下游特异性引物， 在依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）的作用下转录合成互补DNA（cDNA），该步称作“逆转录”；随 后，再以cDNA为模板，利用上游和下游特异性引物，在DNA聚合酶的作用下进行PCR循环扩增；最 终使RNA分子的某个特定区域（目的片段）被扩增达几百万倍。 1 SN/T 3954—2014 3.3 实时荧光RT-PCRreal-timefluorescenceRT-PCR 通过荧光染料或荧光标记的特异性荧光探针，对反转录后PCR扩增的产物进行标记跟踪，利用荧 光信号累积实现实时在线监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行定性和定量分析。 本标准所采用的荧光探针是TaqMan水解探针。该探针为一段寡核苷酸分子，在5端和3'端分别标 记荧光报告基团（如FAM)和荧光淬灭基团（如TAMRA）。该探针可与PCR产物发生特异性杂交。当 探针保持完整时，淬灭基团抑制报告基团的荧光发射。在PCR扩增时，利用Taq酶的5→3'外切酶活 来并被仪器的荧光探测系统检测到。模板每复制一次，就有一条探针被切断，伴随一个荧光信号的释 放，从而实现荧光信号的累积与PCR产物的数量完全同步。 3.4 Ct 值cycle threshold 在荧光PCR中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1DEPC：diethylpyrocarbonate，焦碳酸乙二酯。 4.2PAGE：polyacrylamidegelelectrophoresis，聚丙烯酰胺凝胶电泳。 4.3HPLC:highperformanceliquidchromatography，高效液相色谱。 4.4bp:basepair，碱基对。 4.5FAM：6-carboxy-fluorescein，6-羧基-荧光素，一种荧光报告基团。 4.6TAMPA：carboxytetramethylrhodamine，羧基四甲基罗丹明。 5检测对象 5.1国境口岸伴发热的尼帕病毒感染的病例或疑似病例 雅信息人 5.2其他申请检验的人员。 6 生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB19489的规定。按照原中华人民共和国卫生部制定的《人间传染的病 原微生物名录》的规定操作相应的试验材料，未经培养的感染材料的操作在BSL-3生物安全实验室内 进行，而在BSL-2生物安全实验室内可操作灭活的材料。PCR防污染措施按WS/T230和SN/T1193 的规定执行。 7主要仪器 7.1二级B型生物安全柜。 7.2台式高速冷冻离心机（最高离心力12000g以上）。 7.3旋涡振荡器。 7.4冰箱：4℃、一20℃和一70℃。 7.5超净工作台。 2