SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3841—2014 出口贝类中诺如病毒和星状病毒的快速 检测 反转录-环介导恒温核酸扩增 (RT-LAMP)法 Rapid detection of norovirus and astrovirus in shellfish for export- Reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification method 业标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3841—2014 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局 本标准主要起草人：魏海燕、曾静、马丹、张西萌、张蕾、 行业标准信息服务平台 SN/T 3841—2014 出口贝类中诺如病毒和星状病毒的快速 检测反转录-环介导恒温核酸扩增 (RT-LAMP)法 1范围 本标准规定了贝类中诺如病毒和星状病毒的反转录-环介导恒温核酸扩增（RT-LAMP）快速检 测法。 本标准适用于贝类中诺如病毒和星状病毒的快速检测。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T2519 贝类中星状病毒检测方法普通PCR和实时荧光PCR方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 3.1Betaine：甜菜碱。 3.3dNTPdeoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷三磷酸。 3.4LAMP：loop-mediatedisothermalamplification，环介导恒温扩增 3.5RNA:Ribonucleicacid,核糖核酸 技术概要 利用GPTT法（Glycine-PEG-Trizol-oligodT)或纳米磁珠法提取贝类样品中的病毒RNA：分别选 取星状病毒衣壳蛋白编码基因（ORF2)5端、GI型和GⅡ型诺如病毒ORF1与ORF2接头处的高度保 守序列，设计5条～6条RT-LAMP引物，特异性识别病毒RNA上的7个～8个独立区域，在具有链置 换作用的Bst酶、AMV反转录酶作用下，于等温条件（63℃或65℃）保温60min，即可一步实现对病毒 RNA的高效扩增。扩增反应产生大量副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，在反应管中加入SYBR GreenI荧光染料，阳极反应呈荧光绿色，而阴性反应为荧光橙色。 5试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。 1 SN/T 3841—2014 5.1引物：RT-LAMP扩增引物序列见表1，引物设计示意图参见附录A。 表1RT-LAMP扩增引物 病毒名称 引物名称 序列（5-3） 外侧上游引物（Ast-F3) GCAGGTAACTGTTGAGGTCA 外侧下游引物（Ast-B3） GGTTTTGGTCCTGTGACACC 内侧上游引物（Ast-FIP) CTGCTCTGTCCCGCCCTCTAATGGCCGCAACAGGAGTA 星状病毒 内侧下游引物（Ast-BIP) AGGACTAGAAGACAGCCCGGATGACAATGTTACGGACACGT 环状上游引物（Ast-LF） TTGTGAGCGGGCCCTTG 环状下游引物（Ast-LB) CGCGGCAAACATCAATCTTCTCA 外侧上游引物（GI-F3） TCTACATTCCTGGGTGGCA 外侧下游引物（GI-B3) CCCAGCTACTGGTTCCATTG GI型诺如病毒 内侧上游引物（GI-FIP) AGGAGATCGCGATCCCCTGTCCCATGTTCCGCTGGATGC 内侧下游引物（GI-BIP) GCGTCTAAGGACGCCCCAACGGCTCAGCTGTATTTGCCT 环状上游引物（GI-LF) ACATGCTCAGATCATGGAAGC 外侧上游引物（GⅡ-F3) GCCCCAACCATGAAGACC 外侧下游引物（GII-B3) ACGTGCTCAGATCCGAGAA GII型诺如病毒 内侧上游引物（GIⅡI-FIP) GAATGCTGGGCCGTGGAGTGTGATACCACACTCCCAGAGG 内侧下游引物（GIⅡ-BIP) TGCAGAGTTGAAGGAAGGTGGCCCATCTGAACATCGGCTCTT 环状上游引物（GⅡ-LF) CCATCAAAGACATCAATTGTATGGG 注：RT-LAMP引物的设计分别参照1型星状病毒Pune/063681/India毒株的衣壳蛋白编码基因（ORF2)5端核 酸高度保守序列（accessionNo.JF327666）、GI型和GⅡ型诺如病毒ORF1与ORF2接头处高度保守序列 （GI型诺如病毒accessionNo.U04469，GI型诺如病毒accessionNo.X86557）。 5.2AMV反转录酶：10U/μL。 5.3 dNTP:10 mmol/L 5.4Bst酶:8U/μL。 服务平 KCl,20 mmol/L,MgSO,1%Triton X-100。 5.6MgSO:50mmol/L。 5.7甜菜碱：5mol/L。 5.8显色液：浓度为1000XSYBRGreenI。 5.9 9阳性对照：GI型诺如病毒/GⅡ型诺如病毒/星状病毒阳性样本由具备相关资质的实验室提供，添 加于已知的阴性贝类样品中，制成阳性质控样品；也可选用含扩增目的基因的体外转录RNA分子（经 荧光RT-PCR验证，紫外分光光度计进行定量后，稀释成100拷贝/uL，分装成小份冻存于一80℃，避 免反复冻融，保存期限可达一年）作为RT-LAMP扩增时的阳性对照，病毒目的基因序列参见附录A。 6仪器和设备 6.1移液器：量程分别为0.5μL~10μL、10μL~100μL、100μL~1000μL。 2