SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3558—2013 马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法 RT-PCR and real time RT-PCR detection methods of Marburg virus 行业标准信息服务平台 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3558—2013 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国科学院武汉病毒研究所。 本标准主要起草人：洪烨、师永霞、袁志明、郑夔、相大鹏、黄代、李小波、黄吉城、幸芦琴、郭波旋、 钟玉清、李燕。 行业标准信息服务平台 SN/T3558—2013 马尔堡病毒RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了国境口岸马尔堡出血热检测的生物安全要求，标本的采集、运输和保存，标本的处理， 马尔堡病毒RT-PCR检测和实时荧光RT-PCR检测方法 本标准适用于国境口岸人出境人员携带马尔堡病毒的分子生物学检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 人间传染的病原微生物名录（卫生部） 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 RT-PCR：反转录-聚合酶链反应 实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数 RNA：核糖核酸 FAM:FAM荧光染料，一种荧光报告基团 标准信息服 4术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 4.1 马尔堡出血热Marburghemorrhagicfever；MHF 由马尔堡病毒（MarburgVirus）引起的、以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病， 经密切接触传播，传染性强，病死率高。由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，又被称为 青猴病和非洲出血热。 4.2 马尔堡病毒Marburgvirus 属丝状病毒科，病毒基因组为单股负链RNA，长约19kb，编码7种病毒蛋白，包括N蛋白（NP）、 病毒蛋白35（VP35）、病毒蛋白30（VP30）、病毒蛋白24（VP24）、糖蛋白4（gp4）、RNA依赖的RNA聚 合酶主要成分糖蛋白7（gp7）和次要成分病毒蛋白40（VP40）。 5生物安全要求 按照GB19489和《人间传染的病原微生物名录》的要求，马尔堡病毒相关材料的生物安全要求 1 SN/T 3558—2013 如下： 马尔堡病毒相关的病毒培养和动物感染实验操作应在生物安全IV级（BSL-4或ABSL4）实验 室内进行； -马尔堡病毒相关的未经培养的感染性材料的操作应在生物安全Ⅲ级（BSL-3)实验室内进行； 一马尔堡病毒相关的灭活材料的操作应在生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室内进行； 马尔堡病毒感染材料的运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。 6人体血清标本的采集、运输和保存 无菌采集疑似病例发病3天内静脉血3mL~5mL，室温静置30min使其凝固，500g离心10min， 收集血清于2mL无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔记上编号，低温送到实验室检测。如24h内 不能送到实验室，将血清置于一70℃保存。 7血清标本的处理 血清标本直接进行分子生物学核酸的提取，如24h不能及时检测应存放在一70℃冰箱。 马尔堡病毒的RT-PCR检测 8.1主要仪器 本方法使用的主要仪器如下： PCR扩增仪； 行业标准信息服务平台 千分之一天平； 超净工作台； Ⅱ级生物安全柜； 高压灭菌锅； 低温高速离心机：最大离心力20000 电泳仪； 凝胶成像分析系统； 旋涡振荡器； 冰箱：4℃、-20℃和-70℃； 移液器：10μL、20μL、100μL、200μL和1mL； 恒温水浴锅。 8.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均采用分析纯。本方法使用的主要试剂如下： 核酸提取试剂：用美国Qiagen公司QIAampViralRNAKit提取病毒核酸； RT-PCR试剂：美国Qiagen公司OnestepRT-PCRkit； 无RNA酶的DEPC水； 1）由指定单位提供，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具 有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2