ICS13.060 CCS c 51 WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T 799—2022 污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测 方法标准 Method for enrichment and nucleic acid detection of SARS-CoV-2 in sewage 行业标准信息服务平台 2022-03-24发布 2022-03-24实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会发布 WS/T799—2022 前言 本标准由国家卫生健康委环境健康标准专业委员会负责技术审查和技术咨询，由中国疾病预防控 制中心卫生标准处负责协调性和格式审查，由国家卫生健康委员会疾控局负责业务管理、法规司负责统 筹管理。 本标准起草单位：中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、清华大学、中国科学院生态 环境研究中心、中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。 本标准主要起草人：张岚、唐宋、黄霞、杨敏、张晓、张良、王园媛、刘艳臣、田哲、段招军。 行业标准信息服务平台 I WS/T799—2022 污水中新型冠状病毒富集浓缩 和核酸检测方法标准 1范围 本标准规定了污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测方法。 本标准适用于生活污水、医疗机构污水中新型冠状病毒富集浓缩和核酸检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本标准必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本标准；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 标准。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 WS/T697新冠肺炎疫情期间特定人群个人防护指南 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 新型冠状病毒severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2 属于β属冠状病毒，基因组为线性单股正链的RNA病毒，全长约30kb，有包膜，呈圆形或椭圆形颗 粒状，直径为60nm～140nm。 3. 2 Ct值cyclethreshold 在实时荧光定量PCR中，每个反应体系中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 3.3 实时荧光反转录聚合酶链式反应real-timefluorescent reverse transcriptionpolymerase chain reaction 在反转录DNA聚合酶链式反应的扩增反应中加入荧光化学物质，通过对扩增反应中每一个循环产 物荧光信号的实时检测实现对起始模板定量及定性的分析方法。 4检出限 富集浓缩采用聚乙二醇沉淀法或铝盐混凝沉淀法时，方法检出限为10copies/mL；富集浓缩采用离 心超滤法时，方法检出限为100copies/ml。 5水样的采集、运输及保存 根据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置对未经消杀处 理的污水进行采样。用无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为300mL。可根据现场条件和检测需求确 定水样采集方式，如瞬时水样（采样点位某一时间随机采集的样本）或混合水样（同一采样点位不同时 间所采集的瞬时水样混合后的样本）。样本采集后应在现场使用75%酒精对采样瓶外表面进行消毒，然 后将采样瓶装入密封采样袋中，对密封采样袋外表面再次进行消毒，并尽快将样本送至实验室，运输过 程中确保0℃～4℃条件下冷藏运输。到达实验室后样本同样应保存于0℃～4℃环境中，实验室应在 接到样本后24h内进行富集浓缩处理，并在富集浓缩后24h内完成核酸提取及实时荧光反转录聚合酶链 式反应（实时荧光RT-PCR）检测。 6病毒灭活 1 WS/T799—2022 将样本充分混匀后置于60℃水浴30min。 注：水浴锅水位应高于样本液面，确保容器内样本达到目标温度。 7病毒富集浓缩 注：本部分中三种新型冠状病毒富集浓缩方法适用条件相同，使用过程中可根据实验条件进行选择 7.1聚乙二醇沉淀法 7.1.1原理 向污水中加入聚乙二醇，聚乙二醇在一定盐浓度条件下可使病毒颗粒形成多聚体，在一定离心力下 将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，用于后续核酸提取和实时荧光 RT-PCR检测。 7.1.2试剂和材料 7.1.2.1试剂 7.1.2.1.1聚乙二醇：分子生物学级，平均分子量8000。 7.1.2.1.2氯化钠：分子生物学级。 7.1.2.1.3无核酸酶水：分子生物学级 7.1.2.2材料 7.1.2.2.1无菌带盖离心管：1.5mL，无核酸酶；50mL或250mL，可承受离心力≥12000g。 7.1.2.2.2无菌移液器吸头：1mL，带滤芯，无核酸酶。 7.1.2.2.3无菌移液管：50mL。 7.1.3仪器设备 7.1.3.1高速冷冻离心机：4℃，50mL或250mL转子，可承受离心力≥12000g。 7.1.3.2电子天平：分辨力不低于0.001g。 7.1.3.3生物安全柜：II级或II级以上。 7.1.3.4高压灭菌器。 7.1.3.5移液器：1mL。 7.1.3.6大容量电动移液器 7.1.4富集浓缩步骤 7.1.4.1预离心 用大容量电动移液器分别移取3份35mL污水样本置于3个50mL离心管中，在4℃、2500g条件下离 心30min，将上清液分别转移到另外3个50mL离心管中备用。剩余污水样本作为备份 注1：当污水样本悬浮物含量过高，可能影响病毒核酸提取和实时荧光RT-PCR检测时，应采用预离心弃除悬浮物后再 进行后续操作。 注2：若选用250mL离心管，可直接取105mL污水样本于250mL离心管中，在上述条件下离心后将上清液转移到另外 1个250mL离心管中备用。 VX 7.1.4.2第二次离心 在3个装有35mL污水样本或预离心后上清液的50mL离心管中分别加入3.5g±0.1g聚乙二醇和 条件下离心120min，离心机降速时不应使用制动力。离心机停止后倾倒并弃除离心管中的上清液，至 无上清液流出。 注：若选用250mL离心管，在装有105mL污水样本或预离心后上清液的250mL离心管中操作时，聚乙二醇和氯化钠 用量应等比例增加，其他操作相同。 7.1.4.3富集浓缩 7.1.4.3.1在4℃、12000g条件下将第二次离心后剩余的样本再次离心5min，离心机降速时不应使 2