ICS11.020 WS C50 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T360—2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南 Guidelines for peripheral lymphocyte subsets by flow cytometry 行业标准信息服务平台 2011-12-14发布 2012-06-01实施 中华人民共和国卫生部 发布 WS/T360—2011 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草 本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。 本标准主要起草单位：中国医学科学院北京协和医院。 本标准主要起草人：崔巍、黄春梅、王斐、杨卓、陈倩 行业标准信息服务平台 Ⅱ WS/T360—2011 流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南 1范围 本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群（T细胞、B细胞、NK细胞、CD1T细胞和 CD8+T细胞）的技术要点，包括标本采集和运输、免疫荧光染色技术、流式细胞仪检测和分析、结果报 告和审核等方面。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 分化抗原 cluster of differentiation,CD 不同谱系细胞在分化、成熟、活化过程中，出现或消失的细胞表面标志。细胞表面标志通常用单克 隆抗体来识别。每个抗体都有指定的CD编号，能被特定抗体识别的特定抗原通常具有相同的编号.例 如，被“CD1抗体”识别的抗原称为“CD1抗原”。 2.2 前向散射光 forward anglelight scatterFALS,FSC,FS 光学检测器在入射光的正前方所收集的低角度光信号，与细胞或颗粒的大小和体积有关 2.3 侧向散射光 sidescatter.SSC 光学检测器在入射光的直角处所收集的细胞散射的光信号，与细胞或颗粒的内部和表面结构复杂 程度有关，如细胞质颗粒性、膜不规则性及核形等。 2.4 荧光强度fluorescenceintensity 结合到细胞或颗粒上的荧光素的量。荧光信号的通道数越大提示荧光强度越强。在恰当的条件 下，荧光强度与一个细胞和特定荧光素相结合的位点数相关 2.5 自发荧光 autofluorescence 未染色细胞白身发出的荧光。通常由嘧啶和黄素核苷酸所产生，白发荧光的强度取决于激发光的 波长，且随所分析细胞的类型和（或）细胞活化状态而改变通过特殊的标本处理方法可以降低自发荧 光的强度（如用结晶紫孵育）。 2.6 颜色补偿 colorcompensation 由于一种荧光素发射的荧光叠加到其他荧光素发射的波长范围内而造成荧光信号重叠，通过在其 他荧光信号中扣除已测定荧光信号的一部分而纠正颜色重叠造成的计数错误。扣除的荧光量是用恰当 的单染对照来确定的.被校正的信号反映了单荧光信号的发射情况 2.7 设门gate 1 WS/T360—2011 的细胞群，对限定区内的目的细胞群通过其他参数（如荧光参数）进一步分析其表达情况 2.8 双平台方法dual-platformmethod，DP 用于流式细胞术测定细胞绝对计数的一种方法，结果来源于流式细胞仪和第二种仪器的检测。第 二种仪器通常是血细胞分析仪。流式细胞仪用于获取出现于较多量靶细胞群中的目的细胞亚群的比 例，靶细胞群通常是淋巴细胞群或白细胞群。用第二种仪器分析同一标本靶细胞群的绝对浓度。这两 个测定结果相乘所得即为目的细胞群的绝对浓度。该方法的缺点是包含两种体系的系统误差。 2.9 单平台方法single-platformmethod，SP 用于流式细胞术测定细胞绝对浓度的一种方法，所有结果均来自流式细胞仪一台仪器的测定。浓 度的测定可以直接通过测定体积的方法或间接的通过加入已知浓度的荧光微球来计算。单平台方法免 去了第二台仪器的所产生的系统误差。 3试剂 3.1荧光素标记的单克隆抗体 采用荧光素直接标记的单克隆抗体（单抗），称直标抗体。选择直标抗体是淋巴细胞亚群分析的关 键步骤，要考虑所选抗体对细胞的反应性 3.1.1单抗 CD45、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56。 3.1.2单抗对细胞的反应性 CD45表达于所有白细胞；CD3表达于T淋巴细胞；CD4表达于T辅助/诱导淋巴细胞（CD4+T细 胞）和单核细胞；CD8表达于细胞毒T细胞（CD8+T）和NK细胞；CD19表达于B淋巴细胞；CD16表达 于NK细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和树突状细胞等；CD56表达于NK细胞和细胞毒T细胞。 3.1.3单抗对淋巴细胞亚群的鉴定 CD4、CD8、CD16和CD56单抗均不能特异性标记淋巴细胞某一亚群。采用CD45和（或）CD3作为 设门抗体，同时兼做质控试剂。CD3-T细胞标记为CD3*CD4+T细胞标记为CD3+CD4+CD8+T 细胞标记为CD3+CD8+B细胞标记为CD3-CD19+NK细胞标记为CD3-CD56+或CD3-CD(16+ 56)*。 3.1.4直标抗体常用荧光染料 异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE/RD1）、藻红蛋白偶联物（PECY5）、多甲藻叶绿素蛋白 （PerCP）、藻红蛋白-德州红偶联物（ECD）和别藻青蛋白（APC）。除别藻青蛋白（APC）外，其他荧光染 料均采用488nm的激发光源激发，最大发射波长分别为525nm、575nm、670nm、675nm和613nm。 别藻青蛋白（APC）的激发光源为630nm，最大发射波长为660nm。 3.2溶血素 使用与仪器相匹配的溶血素（内含固定液），并严格按照使用说明和注意事项进行操作。如果使用 没有固定作用的溶血剂（如氯化铵和低渗缓冲液等），染色后标本需要保存在4℃，并在1h内完成上机 2