ICS65.020.01 CCS B 16 中华人民共和国国家标准 GB/T 40140—2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of grape spike-stalk brown spot 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T40140—2021 前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。 本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波海关。 本文件主要起草人：吴品珊、段维军、雷荣、徐晗 GB/T 40140—2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法 1范围 本文件规定了葡萄轴枯病菌的分离培养、形态学鉴定、分子生物学鉴定方法。 本文件适用于葡萄上葡萄轴枯病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 4葡萄轴枯病菌的分类信息 中文名：葡萄轴枯病菌 英文名：grapespike-stalkbrown spot 病原学名及中文名：Alternariaalternata（Fr.）Keissler，链格孢 异名:Alternaria alternata var.rosicola V.G.Rao,Alternaria fasciculata (Cooke &Ellis)L.R Jones &.Grout,Alternaria rugosa McAlpine,Alternaria tenuis Nees,Alternaria tenuis f.chalaroides Sacc.,Alternaria tenuis f.genuina Unamuno,Alternaria tenuis f.trichosanthis D.Sacc.、Alternaria tenuis var, mali Marchal &. E.J. Marchal,Macrosporium fasciculatum Cooke &. Ellis,Torula alternata Fr. 分类地位：真菌界Fungi，子囊菌门Ascomycota，座囊菌纲Dothideomycetes，格孢腔菌目Pleospo rales，格孢腔菌科Pleosporaceae。 葡萄轴枯病菌的其他信息见附录A。 5 方法原理 依据病害症状、分离菌的形态特征和分子生物学特性，根据该真菌DNA保守区的特异性进行常规 PCR或实时荧光PCR检测，通过电泳条带大小或扩增曲线的变化，对病菌进行综合检疫鉴定。 6试剂、材料和培养基 6.1试剂和材料 除有特殊说明外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂。 试剂包括：次氯酸钠溶液（活性氯>10%）、琼脂粉、葡萄糖、琼脂糖、无菌双蒸水、CTAB提取缓冲 液、Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、无水乙醇、RNaseA、液氮、苯酚、氯仿、蛋白酶K、TaqDNA 1 GB/T40140—2021 聚合酶、dNTP、TaqManMasterMix、核酸染料、DNA分子质量标准物等。 材料包括：植物基因组提取试剂盒、普通PCR反应试剂盒、TaqMan荧光PCR反应试剂盒、50X TAE电泳缓冲液。 6.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA），具体配方的信息见附录B。 7仪器和用具 7.1仪器 生物显微镜（放大倍数400倍以上）、体视显微镜、二次纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作 台、制冰机、离心机、PCR仪、实时荧光PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平（感量0.01g）、冰箱 7.2用具 1.5mL），塑料研杆，液氮罐。 8检疫鉴定方法 8.1症状检查与病害症状 观察葡萄果穗分枝穗轴部位是否有变褐干枯，果粒是否失水萎焉，表皮是否有褐斑或霉状物 病害症状主要在幼穗的分枝穗轴上，初期有褐色水浸状斑点，后向主穗轴扩展形成褐色病斑，穗轴 变褐坏死，不久失水干枯，花穗易在分枝处折断，严重时，整个穗轴及其果柄全部变褐坏死，花蕾或花儿 乎全部落光。幼小果粒发病表皮上有圆形深褐色小斑，果粒膨大，病斑表面呈疮状，病痴脱落，果穗也 萎缩干枯。湿度大时病斑上可见黑色霉层，即病菌菌丝、分生孢子梗、分生孢子链和分生孢子。病害症 状见图A.1。 8.2分离培养 将葡萄穗轴用流水冲洗干净，在穗轴的病健交界处切取0.5cm～1.0cm左右的小段，用1%次氯酸 钠消毒5min，无菌水冲洗3次，置于灭菌滤纸上吸去表面水分，放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （PDA）或带三层无菌湿滤纸的培养皿上，在25℃下，两支40W灯管（色温4200K)12h光照、12h黑 暗交替培养3d~4d，灯管距离培养物约40cm。 有疑似菌落的培养Ⅲ置于体视显微镜50×下观察，用解剖针挑取具有典型产孢结构的单根孢子链 上的单个孢子，转接于马铃薯胡萝卜琼脂培养基（PCA）上，在22℃下，两支40W灯管（色温4200K） 8h照射和16h黑暗交替进行培养，灯管距离培养物约40cm，培养物面向上，1周后观察。 8.3形态学鉴定 8.3.1培养物观察与测量 将上述培养物在体视显微镜50×下观察分生孢子梗产生的分生孢子和分生孢子链的特征（产孢表 型），显微镜下测量分生孢子大小包括长、宽、喙长、横纵（斜）隔膜数，抱子颜色，抱子表面有无突起等，测 量分生孢子和喙胞的大小各30个。 2 GB/T40140—2021 8.3.2病菌形态学特征 葡萄轴枯病菌菌落深灰色至暗青褐色，菌丝密集，褐色，分隔，多分枝。分生孢子梗单生或簇生，直 立或弯曲，有分隔，在其上部形成具短分枝的分生抱子链。分生抱子单生或短链生，近椭圆形、卵形或倒 棍棒状，呈淡褐色至暗褐色，表面光滑或具微刺；成熟时具2个～8个横隔膜，1个～4个纵、斜隔膜；分 生孢子一般2个～8个串生在一起，单生较少，大小（17.5μm～40.0μm）×（5.0μm～12.5μm），平均 26.5um×9.1um，短喙圆柱形或锥形，褐色，大小（2.5μm~12.5μm）×（2.5um~5.0μm），部分转变为 产孢细胞，可二次分枝或产孢。形态图见附录A中A.4。 8.4分子生物学鉴定 8.4.1DNA提取 将分离的疑似病菌收集，放人浸在液氮里的1.5mL离心管中，用一次性塑料杆碾碎，按照CTAB 法或植物基因组提取试剂盒提取DNA。DNA提取方法按照附录C操作。 8.4.2常规PCR检测 采用特异性引物AaltFor/AaltRev，按照附录D进行常规PCR检测 8.4.3实时荧光PCR检测 采用实时荧光PCR特异性引物OPAF/R和TaqMan探针OPAP，按照附录E进行实时荧光PCR 检测。 9结果判定 病害症状和分离物的形态特征与8.1和8.3描述的一致，且常规PCR特异性引物扩增结果符合附 录D为阳性或实时荧光PCR检测结果符合附录E为阳性，可判定为检出葡萄轴枯病菌。 10 样品和档案保存 10.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。检出葡萄轴枯病的样品经登记签字，保存于4℃冰箱中，至 少保存6个月以备复核，保存期满后应经高压灭菌后方可处理。对不需要长期保存的染病材料应及时 高压灭菌处理。 10.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员 和审核人员签字。 3 GB/T40140—2021 附录A （资料性） 葡萄轴枯病的其他信息 A.1危害情况 葡萄轴枯病也叫葡萄穗轴褐枯病，发病一般在开花前后。主要危害葡萄幼嫩的穗轴，使穗轴变褐枯 死，危害严重。 传播途径：病菌以分生孢子在葡萄枝蔓表皮以及在病残体越冬，为翌年初侵染来源。葡萄开花前至 开花期为病菌的主要侵染时期，以分生孢子通过伤口或自然孔口侵入幼穗穗轴的表皮组织。病菌近距 离传播主要靠染病穗轴上的分生孢子和农事操作，远距离传播主要靠葡萄贸易 葡萄轴枯病在我国一些葡萄产区有分布，多雨或空气湿度大的地区和年份发生较多。严重时，发病 穗率可达20%～40%，导致减产10%～30%，严重的减产40%以上。该病害是新西兰和澳大利亚进口 中国鲜食葡萄上关注的有害生物。 A.2病原菌情况 引起葡萄轴枯病的致病病原菌一直存有争议，最早国内认为葡生交链孢菌（Alternariaiticola）是 致病菌，国外研究认为是由链格孢菌（Alternariaalternata）引起。近年经广泛搜集资料和采集样本，发 现引起国内葡萄轴枯病的致病菌非以往报道的葡牛交链孢菌（Alternariauiticola），而主要是链格孢菌 (Alternaria alternata)。 A,3病害症状 葡萄轴枯病菌病害症状见图A.1。 图A.1葡萄轴枯病菌病害症状 A.4病菌形态特征 葡萄轴枯病菌分生孢子链和分生孢子见图A.2。 4 GB/T 40140—2021 分生孢子链 b) a) 分生孢子 注：引自WoudenbergJ.H.C.等，2013。 图A.2 葡萄轴枯病菌分生孢子链和分生孢子（图中标尺为10μm） 5