ICS 07.080 CCS A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 39995—2021 留醇类物质的测定 Determination of sterols 2021-04-30发布 2021-11-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T39995—2021 前言 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本文件起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、中国计量大学、四川大学、惠州市食品药品检验 所、北京工商大学、浙江省检验检疫科学技术研究院、河北省食品检验研究院、北京萨姆博科技有限 公司。 黄超群、叶善蓉、周李华、崔海峰、许益鹏、申屠旭萍、李翼、陈丽、吴娟、贾英民、张岩、郝帅。 1 GB/T39995—2021 留醇类物质的测定 1范围 本文件规定了留醇类物质的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本文件适用于猪油、菜籽油、核桃、山楂、油麦菜、葛根、大米、小麦、黑青豆中游离态的胆笛烷醇、菜 籽留醇、菜油留醇、豆留醇、β-谷醇、岩藻留醇、羊毛留醇、豆留烷醇、麦角留醇含量的测定、 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于 本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T15687动植物油脂试样的制备 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 笛醇类物质sterols 一类含环戊烷多氢菲碳架结构的化合物。 4原理 样品经无水乙醇回流提取，提取液过0.22um尼龙滤膜后供液相色谱-质谱/质谱仪测定，标准曲线 内标法定量。 C 试剂或材料 除非另有说明，本方法使用的试剂均为分析纯。水为GB/T6682规定的一级水。 5.1甲醇：色谱纯。 5.2无水乙醇：色谱纯。 5.3笛醇标准品：胆笛烷醇、菜籽笛醇、菜油笛醇、豆笛醇、β-谷笛醇、岩藻笛醇、羊毛笛醇、豆笛烷醇、麦 角留醇、6-酮胆留烷醇，化合物信息参见附录A中表A.1，纯度均≥93%。 5.4内标储备液：准确称取适量6-酮胆留烷醇标准品（精确至0.01mg），用无水乙醇溶解并配制成质量 浓度为500mg/L的内标储备溶液，于0℃～4℃下避光保存备用，有效期为1个月。 5.5内标工作溶液：准确移取内标储备液2.0mL于1000mL容量瓶中，加无水乙醇稀释并定容至刻 度，混匀，配制成质量浓度为1.0μg/mL内标工作溶液，现配现用 5.6笛醇单一标准储备液：分别准确称取适量的留醇标准品（精确至0.01mg），用无水乙醇溶解并配制 21 1 GB/T39995—2021 成质量浓度均为500mg/L的留醇单一标准储备溶液，于0℃～4℃下避光保存备用，有效期为1个月。 5.7留醇混合标准溶液：分别准确移取各留醇单一标准储备液2.0mL于50mL具塞离心管中，于 40℃下氮气吹干，准确加人10mL内标工作溶液复溶，混匀，配制成质量浓度均为100mg/L的备醇 混合标准溶液，现配现用。 5.8笛醇混合标准工作溶液：准确移取适量留醇混合标准溶液，用内标工作溶液稀释配制成质量浓度 分别为20mg/L、10mg/L.5mg/L、2.5mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L0.25mg/L的系列笛醇混合标准 工作溶液，现配现用。 5.9 0.22um尼龙滤膜。 6 仪器设备 6.1 液相色谱-质谱/质谱仪（LC-MS/MS）：配大气压化学离子源（APCI）。 6.25 分析天平：感量为0.0001g、0.01g和0.01mg。 6.3 涡旋混匀器。 6.4回流冷凝装置。 6.5氮吹仪。 6.6粉碎机。 6.7匀浆机。 6.8 离心机。 7样品 7.1# 猪油、菜籽油 按GB/T15687的规定进行制备 7.2核桃、山楂、大米、小麦、油麦菜、葛根、黑青豆 取核桃、山楂、大米、小麦、黑青豆等有代表性干制样品约1kg，用粉碎机粉碎，混勾，制备好的试样 均分成两份，装人洁净的盛样容器内，密封并标识，于0℃～4℃下避光保存，尽快测定。 取油麦菜、葛根等有代表性新鲜样品约1kg，用匀浆机制成匀浆，制备好的试样均分成两份，装入 洁净的盛样容器内，密封并标识，现制现用。 8试验步骤 8.1试样处理 8.1.1猪油、菜籽油 称取试样0.4g（精确至0.001g）于250mL圆底烧瓶中，加入70mL内标工作溶液（5.5），称重，充 分混匀后放人回流冷凝器中，加热并保持提取液微沸，30min后停止加热并冷却至室温，用无水乙醇 （5.2）补足失重，混匀，吸取5mL提取液于8000r/min下离心5min，取2mL上清液过0.22μm尼龙 滤膜，待测。 8.1.2核桃、山楂、大米、小麦、油麦菜、葛根、黑青豆 称取试样1.0g（精确至0.001g）于250mL圆底烧瓶中，加入70mL内标工作溶液（5.5），称重，充 GB/T39995—2021 分混匀后放入回流冷凝器中，加热并保持提取液微沸，30min后停止加热并冷却至室温，用无水乙醇 （5.2）补足失重，混匀，吸取5mL提取液于8000r/min下离心5min，取2mL上清液过0.22μm尼龙 滤膜，待测。 8.2测定 8.2.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下所示： a) 色谱柱：Cls柱，1.8um，3.0mmX150mm，或同等性能的色谱柱； 流动相：流动相A为水，流动相B为甲醇，梯度洗脱程序见表1； c) 流速：0.5mL/min； d) 柱温：30℃； e) 进样量：5μL 表1流动相梯度洗脱程序 时间/min 流动相A体积分数/% 流动相B体积分数/% 20 0 80 15 0 100 30 0 100 30.1 20 80 40 20 80 注：不同型号仪器可做适当调整。 8.2.2 质谱参考条件 质谱参考条件如下所示： a) 离子源：大气压化学离子源（APCI)； b) 扫描方式：正离子模式； 检测方式：多反应监测（MRM）； 5740 d）干燥气、雾化气、碰撞气均为高纯氮气；使用前应调节各气体流量以使质谱灵敏度达到检测要 求，参考条件参见附录B； 喷雾电压、源内碎裂电压、碰撞气能量等参数应优化至最佳灵敏度，参考条件参见附录B。 e) 注：不同型号仪器可做适当调整。 8.2.3定性测定 在相同试验条件（见8.2.1、8.2.2）下进行样品测定时，如果样品中待测物质的保留时间与标准工作 溶液中对应的保留时间一致（变化范围在士2.5%以内），且样品谱图中被测组分监测离子的相对丰度和 标准品的相对丰度一致，允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度/% >50 >20~50 >10~20 允许的相对偏差/% ±25 ±30 ±20 ±50 3 GB/T39995—2021 8.2.4定量测定 在相同试验条件（8.2.1、8.2.2），将备醇系列混合标准工作溶液由低到高浓度依次进样分析，以被测 物和内标物的定量离子峰面积之比为纵坐标，以被测物浓度为横坐标，绘制内标标准工作曲线，用内标 标准工作曲线对样品进行定量，应使样品溶液中各被测物的响应值在仪器测定的线性范围内，如果含量 超过标准工作曲线范围，应稀释到合适浓度后再进样分析。在上述条件下，各留醇类物质的参考保留时 间参见附录B中表B.1，多反应监测图参见附录C。 8.3 平行试验 按8.1和8.2的规定对同一试样进行两次平行测定。 9 试验数据处理 样品中待测物含量的计算见式（1）： X=PxV ..(1) m 式中： X一一试样中被测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； ———从内标标准工作曲线上得到的被测组分溶液质量浓度，单位为微克每毫升（μug/mL)； V——试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m—试样的质量，单位为克（g） 计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位小数。 10 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 11其他 本方法测定9种留醇的定量限参见表A.1。 SAG 4 GB/T39995—2021 附录A （资料性） 留醇化合物信息及定量限 留醇化合物信息及定量限见表A.1。 表 A.1 笛醇化合物信息及定量限 定量限/（mg/kg） 相对分子 序号 中文名称 英文名称 CAS号 分子式 猪油、 核桃、山楂、葛根、油麦菜 质量 菜籽油 大米、小麦、黑青豆 57-87-4 3.50 麦角笛醇 1 Ergosterol Cz H O 396.7 0.70 菜籽笛醇 C2s HaO 398.7 3.50 2 474-67-9 Brassicasterol 0.70 岩藻甾醇 17605-67-3 C2gHasO 412.7 3.50 3 Fucosterol 0.70 羊毛笛醇 3.50 Lanosterol 79-63-0 C3o Hso O 426.7 4 0.70 胆甾烷醇 80-97-7 388.7 3.50 5 Ca, He O β-Cholestanol 0.70 6 412.7 140.00 豆笛醇 C2s Hax O Stigmasterol 83-48-7 28.00 7 菜油笛醇 3.50 400.7 Campesterol 474-62-4 C2s Hax O 0.70 β谷笛醇 3.50 8 Czs Hso O β-Sitosterol 83-46-5 414.7 0.70 Stigmastanol 35.00 豆笛烷醇 416.7 9 19466-47-8 C2 Hs2 O 7.00 6-Ketocholestanol 10 6-酮胆甾烷醇 1175-06-0 Cz, Hus O2 402.7 5