ICS 65.020.30 B 44 中华人民共和国国家标准 GB/T38740—2020 实验动物 猴马尔堡病毒检测方法 Laboratory animalMethod for examination of simian Marburg virus (MARV) 2020-08-01实施 2020-04-28发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38740—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281)提出并归口 本标准起草单位：海南出入境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国福州海关、中华人民 共和国成都海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国济南海关、北京脑科学与类脑研究中心、 中华人民共和国海口海关、中华人民共和国昆明海关。 本标准主要起草人：李丹丹、张体银、安微、王绥家、凌宗帅、李文龙、陈平亚、艾军。 1 GB/T38740—2020 实验动物猴马尔堡病毒检测方法 1范围 本标准规定了猴马尔堡病毒实时荧光RT-PCR检测的操作方法。 本标准适用于猴马尔堡病毒的检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 马尔堡病毒 Marburgvirus 种高致病性病毒，属丝状病毒科（Filoviridae），单股负链RNA病毒，基因组约19.1kb，为已知的 最大的负链RNA病毒。 3.2 逆转录实时荧光聚合酶链式反应 real-time quantitative reverse transcription polymerase chain re- action;real-time RT-PCR 将mRNA逆转录为cDNA后再作为模板进行实时荧光PCR扩增。PCR反应体系中加人一对引 物的同时加入一条特异性的荧光探针，该探针为一寡核酸片段，两端分别标记一个报告荧光基团和一 个萍灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被萍灭基团吸收；PCR特异性扩增时，Taq酶 的5°-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收 到荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 3.3 噪音noise 荧光PCR仪在仅仅使用PCR管和水的状态下的本底荧光强度。 3.4 Ct 值 cyclethreshold value 从基线到指数增长的拐点所对应的PCR反应循环次数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 1 GB/T38740—2020 DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） FAM:6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein) MARV：马尔堡病毒（Marburgvirus） PBS：磷酸盐缓冲液（phosphate-bufferedsaline） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) RT-PCR：逆转录聚合酶链式反应（reversetranscription polymerase chainreaction） SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecyl sulfate） TAMRA：6-羧基四甲基若丹明（6-carboxytetramethylrhodamine） Taq酶：TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane] 5试剂或材料 本标准所用水应符合GB/T6682中一级水的规格要求 5.1 裂解液：Trizol或其他等效裂解液。 5.2 三氯甲烷：异戊醇：体积比24：1。 5.3异丙醇：-20℃预冷。 5.4磷酸盐缓冲液（PBS)：见附录A中的A.1。 5.5 5无RNase水：见A.2。 5.6 75%乙醇：见A.3。 5.7 逆转录酶：一20℃保存，避免温度剧烈变化。 5.8 10XRT-PCR缓冲液。 5.9 dNTPs：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L。 5.10 MgCl2:25mmol/L。 5.11 TagDNA聚合酶：一20℃保存，避免反复冻融或温度剧烈变化 5.12 RNA 酶抑制剂。 5.13 阳性对照：体外转录的、非感染性的、猴马尔堡病毒阳性RNA片段，DNA序列参见附录B。 5.14 阴性组织对照：猴马尔堡病毒阴性组织样品。 5.15 引物和探针，浓度为10μmol/L，序列如下： 上游引物 MARV-F:5'-TTG GTG CGG ACC TCC AAA GT-3'; 下游引I物MARV-R:5-GCGCAATTGCTGAGAGCTGA-3： 探针:5'-FAM-AGCAGGCGTTGAGCAACCTAGCCCGA-BHQ1-3'。 6仪器设备 6.1荧光定量PCR核酸扩增仪。 6.2生物安全柜。 6.3电子天平。 6.4高速冷冻离心机，台式离心机。 6.5冷藏冷冻冰箱。 6.6组织匀浆器。 6.7旋涡振荡器。 2 GB/T38740—2020 6.8微量可调移液器：2μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL。 6.9低温冰箱，温度≤一70℃。 7样品采集 7.1生物安全要求 样品的采集、保存及运输过程中应做好相关人员生物安全保护，并符合GB/T18088的相关要求。 7.2取样工具 棉拭子、剪刀、镊子、离心管、一次性无菌注射器，上述取样工具应无菌。 7.3血液样品 用无菌注射器直接吸取血液至1.5mL无菌抗凝离心管中，编号备用。 7.4肛拭子或者粪便 将灭菌的棉子插入肛门或者粪便中轻轻左右搅动，然后将拭子放入装有1.5mLPBS的离心管 内，加盖、编号。棉拭子样品于旋涡振荡器上振荡混匀约5s后，于离心机中瞬时离心，立即使用或 一20℃备用。 7.5内脏样品 用无菌的剪刀和镊子剪取待检动物的肝脏、肾脏、心脏或者脾脏约2.0g于组织匀浆器中，加人 无菌1.5mL离心管中，编号备用。 7.6存放和运送 反复冻融（最多冻融3次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。 8试验步骤 8.1实验室生物安全要求 8.2样本核酸提取 8.2.1在样本处理区进行。为防止RNA降解，所用试验用具及溶液应无RNA酶，操作过程中应佩戴 一次性橡胶或乳胶手套。 8.2.2取200μL病毒液或已处理好的样品加人到无RNA酶的1.5mL离心管中，加人600μLTrizol 试剂，用旋涡振荡器剧烈振荡15s后，室温放置5min。 8.2.3加人200uL三氯甲烷，用旋涡振荡器剧烈振荡15s后室温放置3min，4℃，12000g离心 15 min。 SAG 3 GB/T38740—2020 匀，室温放置10min。 8.2.54℃，12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将液体去除。 8.2.6加人1000uL预冷的75%乙醇，缓慢颠倒洗涤沉淀。 8.2.74℃、12000g离心15min，弃上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥沉淀5min~ 10 min. 8.2.8加入20μLDEPC水，溶解沉淀后，室温孵育10min。提取的RNA应在2h内使用或一70℃冰 箱保存备用。 8.2.9在实验过程中，同时设置阴性对照和以DEPC水空白对照。 8.2.10可采用同等效果的商业化RNA抽提试剂盒代替以上方法 8.3反应体系 取出相应的荧光RT-PCR试剂、引物探针等，在室温下融化后，2000g离心5s。按样品数量配制 反应液，每个反应管包含：10o×RT-PCR缓冲液2μL，25mmol/LMgCl²2μL，2.5mmol/LdNTPs 1.5μL，10μmol/L上下游引物各1μL，10μmol/L探针0.5μL5U/μLDNA聚合酶0.5μL，5U/μl 逆转录酶0.5μL，40U/μLRNA酶抑制剂0.5μL,DEPC水6.5μL。充分混合均匀，向每个反应管中 各分装16μL，转移至样本处理区，最后加人总RNA4μL。 实时荧光PCR扩增可以采用等效的商品化荧光定量PCR试剂盒。 8.4反应程序 50℃反转录30min；95℃预变性5min；95℃变性15s，61℃退火30s，收集荧光，共32个循环。 同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，记录Ct值。可根据不同仪器要求将反应程序做适当调整。 8.5结果判定 8.5.1结果分析条件设定 综合分析仪器给出的各项结果，基线以仪器给出的默认值作为参考，阈值设定原则以阈值线刚好超 8.5.2质控标准 阳性对照样品有对数扩增曲线，而且Ct值<28。 阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线。 二者均成立才可判定试验成立。 8.5.3结果描述及判定 检验样本Ct值≤28，且出现典型的扩增曲线，则判定MARV阳性。 检验样本28<Ct值≤32时，重复一次，如果Ct值仍然≤32，并且曲线有明显的对数增长期，则判 定MARV阳性；否则判定MARV阴性 样本Ct值为零或Ct值>32时，则判定MARV阴性。 4 GB/T38740—2020 附录A （规范性附录） 试剂配方 A.10.01 mol/L PBS NaCl 8.5 g KC1 0.2 g Na2HPO4: 12H20 2.8 g KH,PO4 0.2 g 将上述成分依次溶解，去离子水定容至终体积为1000mL，调pH至7.2,121℃高压灭菌20min， 室温保存。 A.2 无RNase超纯水（DEPC水） 超纯水 100 mL 焦炭酸二乙酯(DEPC) 50 mL 室温过夜，121℃，15min灭菌，或直接购买无RNase超纯水 A.3 75%乙醇 无水乙醇 7.5 mL 无RNase超纯水 2.5mL 现配现用。 5