和巨 家 生代谢产 抑菌圈法 acviy hibition zc 202 国家！ 国家 GB/T38483—2020 前言 按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 圭由中国标准化研究院提出并归口。 起草单位：中国计量大学、中国标准化研 圭主要起草人：申屠旭萍、叶子弘、马爱进 鹏、崔海峰、引 1 38483—2020 微生物源抗生素类次生付 抗细菌活性测定 抑菌 1范围 本标准规定了用抑菌圈法测定微 产物抗细菌活性的方法。 本标准适用于微生物源抗生素类 则定。 2 2规范性 下列文 不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不 新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 格和试验方法 GB19489 实验室 术语和定义 下列术语和定义适） 3.1 抑制中 n inhibitory concentration ICso 对细菌 到50%时的浓度。 3.2 抗细菌旧江 auuwacterial activity 抑制细菌生长繁殖的能力。 3.3 抑菌圈inhibition zone 固体培养基表面与试样接触的边界处无菌繁殖的环带区域。 板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制形成的抑菌I 大独王 应符合 为规定。 6 试剂或 除非另 [试剂均为分析纯。 GB/T38483—2020 6.1 水。GB/T6682—级水。 6.2LB液体培养基。称取胰蛋白陈10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g，然后将上述各成分加于 1000mL蒸饰水巾老油溶解，调节pH至7.0±0.2，分装至锥形瓶中，121℃灭菌20min。 6.3LB固仁 取胰蛋白陈10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g、琼脂20.0g，然后将上述 各成分加于+vvu1然留水中，煮沸溶解，调节pH至7.0士0.2，分装至250mL锥形瓶中，121℃亚菌 20 min. 6.4指示菌标准菌株： 革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）ATCC6538。 革兰氏阴性菌：大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）ATCC11229。 也可以采用其他标准菌株作为供试菌，具体可参照实际情况进行选择。 7仪器设备 7.1恒温培 差在1℃以内。 7.2无菌培 盖，直径90mm。 津杯：不锈钢，标准规格：内径6mm、外径8mm、高10mm。 测量仪：精度0.1mm。 度计：检测波长600nm。 形瓶：容量100mL、250mL。 管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器 8操作步骤 8.1菌株活化 种到装有2mL的LB液 管中，37℃士 2h～18h。用接种环挑 刘线法接种到LB固体平板， ·℃恒温培养籍， v.~24h，然后从平板中挑 取单菌落接种在LB固体培养基试管斜面内，37℃士1℃恒温培养箱中培养18h～24h，后将试管斜面 贮存于1℃～4℃冰箱内作为保存菌，保存期不超过一个月，每月传代一次，传代次数不超过10代 8.2菌悬液制备 8.2.1 用接种环取保存菌，以划线法接种到LB固体平板上，37℃土1℃下培养24h 注：LB固体平板在1℃～4℃条件下保存，1周内使用。 落接种在LB液体培养基内，37℃±1℃培养12h~18h。 8.2.3用LB液体培养基调节培养后的菌浓度至1X10°CFU/mL~5×10°CFU/mL并以此作为试验 菌悬液。采用分光光度计测定试验菌悬液OD600为0.5～0.65或（其他）适当的方法测定菌悬液浓度 注：试验菌悬液在1℃～4℃条件下保存，在4h内使用。 8.3供试样品制备 极性样品直接用水充分溶解（非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解），配制成一定浓度的 母液，经无菌0.45um滤膜过滤，然后用无菌水（或相应的表面活性剂）按2倍或5倍浓度逐级稀释，制 率小于50%分布的浓度点，现配现用。 2 GB/T38483—2020 8.4检测平板制备 将8.2.3中的菌悬液用冷却至55℃左右的LB固体培养基按1：10的比例稀释，充分混匀后取 15mL于无菌培养皿内，轻轻摇动平板使菌液均匀铺平，待其凝固后制成检测平板，备用。 8.5抑菌活性测定 分别将无菌牛津杯轻轻地放在8.4制备的检测平板中，而后用无菌吸管分别将8.3中制备的200uL 不同浓度的供试样品溶液加人牛津杯中，空白对照组加入200μL对应的溶剂，每个处理重复5次。将 照组形成的抑菌圈直径 SZIC 9 结果计算 抑制率按式（1）计算： D1-D2 I = X 100% .(1) D2 式中： 1 抑制率； Dl供试次生代谢产物平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）； D2一一空白对照平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。 以五个平行样的平均值为最终结果，计算结果保留到小数点后两位 根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析，得到回归曲线Y=aX十6，其中Y为抑制 率的概率值，X为药剂浓度对数值，a为回归曲线斜率，b为常数，并给出回归曲线的R?值，计算供试药 剂分别对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的ICso值。 10重复性 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15%。 GB/T38483—2020 8.4检测平板制备 将8.2.3中的菌悬液用冷却至55℃左右的LB固体培养基按1：10的比例稀释，充分混匀后取 15mL于无菌培养皿内，轻轻摇动平板使菌液均匀铺平，待其凝固后制成检测平板，备用。 8.5抑菌活性测定 分别将无菌牛津杯轻轻地放在8.4制备的检测平板中，而后用无菌吸管分别将8.3中制备的200uL 不同浓度的供试样品溶液加人牛津杯中，空白对照组加入200μL对应的溶剂，每个处理重复5次。将 照组形成的抑菌圈直径 SZIC 9 结果计算 抑制率按式（1）计算： D1-D2 I = X 100% .(1) D2 式中： 1 抑制率； Dl供试次生代谢产物平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）； D2一一空白对照平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。 以五个平行样的平均值为最终结果，计算结果保留到小数点后两位 根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析，得到回归曲线Y=aX十6，其中Y为抑制 率的概率值，X为药剂浓度对数值，a为回归曲线斜率，b为常数，并给出回归曲线的R?值，计算供试药 剂分别对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的ICso值。 10重复性 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15%。 GB/T38483—2020 8.4检测平板制备 将8.2.3中的菌悬液用冷却至55℃左右的LB固体培养基按1：10的比例稀释，充分混匀后取 15mL于无菌培养皿内，轻轻摇动平板使菌液均匀铺平，待其凝固后制成检测平板，备用。 8.5抑菌活性测定 分别将无菌牛津杯轻轻地放在8.4制备的检测平板中，而后用无菌吸管分别将8.3中制备的200uL 不同浓度的供试样品溶液加人牛津杯中，空白对照组加入200μL对应的溶剂，每个处理重复5次。将 照组形成的抑菌圈直径 SZIC 9 结果计算 抑制率按式（1）计算： D1-D2 I = X 100% .(1) D2 式中： 1 抑制率； Dl供试次生代谢产物平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）； D2一一空白对照平板中形成的抑菌圈直径，单位为毫米（mm）。 以五个平行样的平均值为最终结果，计算结果保留到小数点后两位 根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析，得到回归曲线Y=aX十6，其中Y为抑制 率的概率值，X为药剂浓度对数值，a为回归曲线斜率，b为常数，并给出回归曲线的R?值，计算供试药 剂分别对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌的ICso值。 10重复性 在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的15%。