ICS 07.080 A 21 中华人民共和国国家标准 GB/T 38475—2020 色素中生物毒素检测 胶体金快速定量法 Detection of mycotoxins in pigmentRapid quantitative method of colloidal gold strip test 2020-11-19发布 2020-11-19实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38475—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司。 本标准主要起草人：崔海峰、叶子弘、马爱进、刘丽强、张明洲、俞晓平、许益鹏、申屠旭萍、张雅芬、 匡华、郝帅。 I GB/T38475—2020 色素中生物毒素检测 胶体金快速定量法 1范围 本标准规定了用胶体金快速定量法检测天然色素产品中生物毒素的方法。 本标准适用于基于天然产物提取及发酵制备的天然色素产品中黄曲霉素B、桔青霉素、玉米赤霉 烯酮、呕吐毒素的快速定量检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 3原理 试样提取液中的生物毒素在层析过程中与检测试剂条中胶体金微粒标记的特异性抗体竞争结合并 发生呈色反应，颜色深浅与试样中生物毒素含量相关。用读数仪检定检测条上检测线和质控线颜色深 浅，根据颜色深浅和读数仪内置曲线自动计算出试样中生物毒素含量。 4 试剂或材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯。 4.1水 GB/T6682，二级水。 4.2 黄曲霉毒素B 纯度≥98%。 4.3 3桔青霉素 纯度≥98%。 4.4玉米赤霉烯酮 纯度≥98%。 4.5 5呕吐毒素 SZIC 纯度≥98%。 1 GB/T38475—2020 4.6 5苯+乙腈混合液 量取98.0mL苯，加2.0mL乙腈，混匀。 4.7 稀释缓冲液 称取2.4228g三羟甲基氨基甲烷，加水溶解，调pH=8.0；加人9.0g氯化钠、5mLTritonX-100 用水定容至1000mL：或采用商品化的同类产品 4.8 370%（体积分数）甲醇溶液提取液 取70.0mL的甲醇加水30.0mL，混匀。 4.9 PBS缓冲溶液 称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用水溶解，调节pH至7.0，用 水定容至1000mL。 4.100.1%（体积分数）吐温20-PBS溶液 移取1mL吐温20，以PBS缓冲溶液定容至1000mL。 4.11 0.1%（体积分数）磷酸溶液 准确移取1mL磷酸，加水定容至1000mL。 4.120.1mg/L的生物毒素标准储备液 分别准确称取一定量的生物毒素标准品，用苯十乙睛（98：2）溶液溶解，容量瓶定容至10mL，配制 0.1mg/L的生物毒素标准储备液，保存于4℃备用，可保存1年。 5仪器设备 5.1 天平：精度0.01g和0.01mg 5.2 粉碎机：转速不低于3000r/min。 5.3 3离心机：转速不低于3000×g。 5.4涡旋振荡器。 5.5 读数仪：可测定并显示胶体金免疫层析试纸条的检测结果 5.6 胶体金免疫层析检测试纸条：性能要求见附录A。 5.7 微量移液器。 5.8 免疫亲和柱：柱体积规格1mL或3mL，柱容量不低于200ng，或等效柱。 6 样品制备 6.1 1试样取样 按照GB/T5491执行。 2 GB/T38475—2020 6.2试样制备 6.2.1固体样品 天平称取有代表性的固体或样品500g，其中300g用粉碎机粉碎至全部通过20目筛，混匀，分两 醇溶液提取液，密闭，用涡旋振荡器振荡2min～3min，静置后用滤纸过滤，或取1.5mL混合液于离心 管中，用离心机离心1min。取滤液或离心后上清液100μL于另一离心管中，加900μL于稀释缓冲液， 充分混匀待测。如样品为特殊材料，需将稀释后的混合液用针头过滤器过滤，即为待测液。 6.2.2液体样品 液体待测样品用均质器，处理不少于2min，充分混匀后，用微量移液器分别吸取1.0mL加人2个 2.0mL离心管中，一份密封冷冻保存，一份用于检测。从待测离心管中吸取200L离心液体样品于另 一离心管中，加入1.8mL稀释缓冲液，充分混勾待测。 6.2.3净化 将免疫亲和柱连接在10mL玻璃针筒下，准确移取10.0mL上述样品滤液过免疫亲和柱，以 1滴/s~2滴/s的流速全部通过亲和柱；加人10mL0.1%吐温20-PBS溶液，以1滴/s~2滴/s的流速 淋洗柱子，直至空气进入到亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.0mL洗脱液进行洗脱，洗脱流速 为1滴/s～2滴/s。收集全部洗脱液于离心管中备用。 注：净化处理仅针对红曲红等对胶体金反应结果产生严重背景干扰的色素产品。 7测定 7.1低温保存的检测试纸条取出后，室温放置20min～30min。 7.2胶体金试剂条：将试纸条浸人含300μL～500μL待测溶液的离心管中，室温孵育5min。 7.3胶体金检测卡：将60μL～80μL待测溶液加人到检测孔中，室温孵育5min。 7.4宜选择胶体金检测试纸条或检测卡生产厂家的读数仪配套使用。 8结果分析 8.1反应结束后，取出胶体金免疫层析检测试纸条或检测卡观察C线（质控线）和T线（检测线）的显 均视为无效检测 完成重复测定3次，读数仪根据内置拟合曲线自动计算并显示样品中相应生物毒素的含量，单位为微 克每千克（μg/kg）或微克每升（μg/L）。 霉毒素B浓度范围为2μg/kg~128μg/kg；桔青霉素浓度范围为40μg/kg~640μg/kg；呕吐毒素浓 度范围为300μg/kg~14400μg/kg；玉米赤霉烯酮浓度范围为40uμg/kg~1920μg/kg。基于标准样 品浓度值与代表T线强度光密度值的积分面积检测数据，采用四参数logistic拟合算法建立标准曲线 拟合程度R²值应在0.99以上。 3 GB/T38475—2020 9 重复性 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20% 10 ）其他 500 μg/kg。 4 GB/T38475—2020 附录A （规范性附录） 胶体金快速检测试纸条性能要求 A.1准确性 采用最低检测限2倍、5倍、8倍浓度水平的实物标准样品，每个浓度水平测定不低于6次。计算检 A.2 精密度 采用最低检测限5倍浓度水平的实物标准样品，测定不低于6次，计算检测条批次内变异系数，变 异系数≤20% A.3 检测限 测定20份阴性样品，计算平均值加3倍标准差，其结果应小于或等于产品灵敏度标示值 A.4批间稳定性 2次，批内测定取平均值，计算检测条批间变异系数，变异系数应小于或等于20%。 A.5 特异性 选取阴性待测样品，加入与目标检测生物毒素可能存在交叉反应的其他生物毒素，除目标检测生物 毒素添加样品检测结果为阳性外，其余添加样品测定结果均为阴性 5