ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T30987—2020 代替GB/T30987—2014 植物中游离氨基酸的测定 Determination of free amino acids in plant 2020-03-31发布 2020-03-31实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T30987—2020 目 次 前言 1 范围 2 规范性引用文件 3 术语和定义 4全自动氨基酸分析仪法（第一法） 5高效液相色谱法（第二法） 6液相色谱-串联质谱法（第三法） 附录A（资料性附录）氨基酸化合物信息及定量限 13 附录B（资料性附录）21种氨基酸混合标准工作溶液色谱图 14 附录C（资料性附录）液相色谱-串联质谱参数参考条件 18 GB/T30987—2020 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T30987—2014《植物中游离氨基酸的测定》。 本标准与GB/T30987—2014相比，主要技术变化如下： 增加了液相色谱-串联质谱法（见第6章）； 修改了方法灵敏度的表示方式（见4.5.5.6、5.5.6.4，2014年版的4.10、5.10）。 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。 本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、中国测试技术研究院、河北省食品检验研究院 本标准主要起草人：李怀平、唐祥凯、杨杰斌、邹燕、赵爱平、吴微、张岩。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T30987—2014。 1 GB/T30987—2020 植物中游离氨基酸的测定 1范围 本标准规定了植物中游离氨基酸含量的测定方法，包括全自动氨基酸分析仪法（第一法）、高效液相 色谱仪法（第二法）和液相色谱-串联质谱法（第三法）三种方法。 本标准适用于茶叶、中药材、烟叶等植物样品中21种游离氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬 氨酸、胱氨酸、-氨基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、丝氨酸、茶氨酸、苏氨酸、酪氨酸、氨酸）的测定。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T8303一2013茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 游离氨基酸 freeaminoacids 植物中未与其他化学物质结合，以单个分子或离子形式存在，可被水溶液或其他溶剂直接浸提出来 的氨基酸。 4全自动氨基酸分析仪法（第一法） 4.1原理 样品中游离氨基酸经沸水提取后，经氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换柱分离后，在135℃下加 热，氨基酸与三酮混合反应，伯胺与三酮生成蓝紫色化合物，仲胺与三酮生成黄色化合物，分别在 570nm和440nm波长下通过可见光分光光度检测器检测两种衍生产物，保留时间定性，外标工作曲线 法定量。 4.2 试剂或材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的一级水。 4.2.1柠檬酸锂（四水）。 4.2.2氯化锂。 4.2.3柠檬酸。 4.2.4氢氧化锂。 4.2.5 硼氢化钠。 1 GB/T30987—2020 4.2.6 无水乙酸钠。 4.2.7 三酮。 4.2.8 无水乙醇。 4.2.9 硫代双乙醇。 4.2.10 聚氧乙烯月桂醚。 4.2.11 辛酸。 4.2.12 苯甲醇。 4.2.13 乙二醇甲醚。 4.2.14 冰乙酸。 4.2.15 氨基酸标准品：丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、天冬酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、胱氨酸（Cys）、 酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、脯氨酸（Pro）、丝氨酸（Ser）、茶氨酸（The）、苏氨 酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、缬氨酸（Val），化合物信息参见附录A中表A.1，纯度均>98%。 4.2.16快速定量滤纸。 4.2.17 70.45um水相滤膜。 4.2.18 0.45μm有机相滤膜。 4.3 仪器设备 4.3.1 氨基酸自动分析仪：配备双通道可见光检测器、六元梯度分离系统和三元反应液输送系统。 4.3.2分析天平：感量0.0001g和0.01mg。 4.3.340目筛：孔径0.425mm。 4.3.4移液器：量程分别为10μL～100μL，20μL～200μ及100μL～1000μL。 4.4样品 样品按GB/T8303一2013中6.1和6.2规定制样，过40目筛。充分混匀，装人洁净的盛样容器内， 作为试样，标明标识。 4.5 5试验步骤 4.5.1标准溶液配制 4.5.1.1混合氨基酸标准储备液配制 称取各氨基酸标准品适量（精确到0.01mg），用水溶解，配制成混合溶液。混合标准溶液中的茶氨 酸和其他20种氨基酸的浓度分别为5.00umol/mL和1.25umol/mL。储备溶液冷冻保存有效期为 1个月。 4.5.1.2混合氨基酸标准工作液配制 准确吸取2mL混合氨基酸标准储备液至5mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混匀，即得到第一 份标准溶液。将第一份标准溶液用水逐级稀释，制成总共7个不同浓度的系列混合标准工作溶液。 500.00nmol/mL,1000.00nmol/mL和250.00nmol/mL，500.00nmol/mL和125.00nmol/mL, 250.00nmol/mL和62.50nmol/ml,125.00nmol/ml和31.25nmol/ml,62.50nmol/ml,和15.63nmol/ml, 31.25nmol/mL和7.81 nmol/mL,现配现用。 2 GB/T30987—2020 4.5.2流动相配制 4.5.2.1流动相B,(pH2.8)配制 称取柠檬酸锂（四水）5.73g，氯化锂1.24g，柠檬酸19.90g，溶于700mL水中，加人30.0mL无水 乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中 用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。 4.5.2.2流动相Bz(pH3.7)配制 称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂6.36g，柠檬酸12.00g，溶于700mL水中，加入30.0mL无水 乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中， 用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。 4.5.2.3流动相B（pH3.6）配制 称取柠檬酸锂（四水）8.79g，氯化锂26.62g，柠檬酸11.27g，溶于700mL水中，加入100mL无水 乙醇，3.0mL苯甲醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水 定容，过0.45um水相滤膜，备用。 4.5.2.4流动相B(pH4.1)配制 称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂38.15g，柠檬酸3.30g，溶于700mL水中，加入4.0mL聚氧乙 烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。 4.5.2.5流动相Bs配制 流动相B，为经0.45um水相滤膜过滤后的水。 4.5.2.6流动相B。配制 称取氢氧化锂8.40g，溶于700mL水中，加入30.0mL无水乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人 0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45um水相滤膜，备用 4.5.3柱后衍生化反应溶液配制 4.5.3.1反应溶液R，配制 称取节三酮39.0g，溶于979mL乙二醇甲醚中，超声溶解5min，过0.45μm有机相滤膜，加人硼 氢化钠81.0mg，氮气鼓泡30min，放置过夜使用。 注：反应溶液R，制备好后宜尽快使用完毕，不宜长期储存。 4.5.3.2反应溶液R2配制 称取无水乙酸钠204.0g，加人300mL水，123mL冰乙酸，401mL乙二醇甲醚，超声至溶解，转移 至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm有机相滤膜，氮气鼓泡10min，备用。 4.5.3.3反应溶液R3配制 准确移取无水乙醇50mL于1000mL容量瓶中，用纯水定容至1000mL，混匀后过0.45μm有机 相滤膜过滤，备用。 3 GB/T30987—2020 4.5.4试样提取 准确称取样品（见4.4）约2.0g（精确至0.0001g）于250mL锥形瓶中，加入200mL沸水冲泡， 95℃水浴加热，每隔5min混匀一次，提取10min后取出，趁热抽滤，滤液冷却至室温后，用水定容至 250mL，混匀后取适量样品溶液，经0.45um水相滤膜过滤后待测。 4.5.5 测定 4.5.5.1 色谱柱 磺酸型阳离子交换柱，3μm，4.6mm×60mm，或同等性能的色谱柱。 4.5.5.2 仪器分离体系运行参考条件 流动相配制见4.5.2，流动相流速为0.35mL/min，流动相及柱温梯度参考条件见表1，仪器进样体 积为20μL。 表 1 氨基酸分析仪分离梯度条件程序 流动相 时间/min 柱温/℃ Bi / % B2 / % B / % B. / % Bs / % B. / % 0.0 100 0 0 0 0 0 88 2.0 100 0 0 0 0 0 30 100 0 21,5 0 0 0 0 30 0 0 21.6 80 20 0 0. 60 32.5 70 30 0 0 0 0 60 32.6 10 90 0 0 0 0 60 36.5 10 06 0 0 0 40 43.5 10 90 0 0 0 0 40 43.6 0 100 0 0 0 40 50.5 100 0 0 0 0 70 100 50.6 0 0 0 0 0 70 0 68.4 100 0 0 0 0 45 69.5 0 100 0 0 0 0 45 69.6 60 0 40 0 0 45 60 74.0 0 0 40 0 45 74.1 100 0 0 0 0 45 82.0 100 0 0 0 0 0 45 82.1 20 80 0 0 0 0 45 92.5 20 80 0 0 0 70 S66 20 0 0 80 0 0 70 99.6 0 0 0 100 0 0 70 4