ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T19167—2020 代替GB/T19167—2003 传染性法氏囊病诊断技术 Diagnostic techniques for infectious bursal disease 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T19167—2020 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准代替GB/T19167—2003《传染性囊病诊断技术》，与GB/T19167—2003相比，除编辑性修 改外，主要技术变化如下： 将“传染性囊病”和“传染性法氏囊病”统一为“传染性法氏囊病”； 一增加了规范性引用文件（见第2章）； 一增加了缩略语（见第3章）； 一增加了器材和试剂（见第5章、第6章、第7章、第8章、第9章）； 增加了临床诊断（见第4章）； 增加了实验室诊断样品采集（见第5章）： 删除了直接免疫荧光法（见2003年版的2.5.2）； 删除了酶联免疫吸附试验（见2003年版的第5章）； 增加了RT-PCR检测方法（见第7章、附录C、附录D）； 增加了实时荧光RT-PCR检测方法（见第8章、附录E）： 删除了血清抗体的检测（见2003年版的第4章）； 增加了细胞培养分离病毒检测方法（见9.4.1、附录F）； 增加了诊断结果的综合判定（见第10章）。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、北京市农林科学院畜牧兽医研究所、中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所。 本标准主要起草人：蒋文明、陈继明、刘月焕、王笑梅、王静静、刘爵、高玉龙、李阳、于晓慧、刘朔、 庄青叶、李金平、侯广宇、祁小乐、王素春、刘华雷。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： -GB/T19167—2003。 GB/T19167—2020 引言 传染性法氏囊病（Infectiousbursaldisease，IBD）又称甘布罗病（Gumborodisease），由双股RNA 病毒科（Birnaviridae）禽双股RNA病毒属（Avibirnavirus）传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起。火鸡、 鸭、珍珠鸡和驼鸟均可感染IBDV。3周龄～6周龄的鸡发病急而且重，病死率高，而1周龄～3周龄鸡 常呈现亚急性或亚临床症状。该病毒侵害法氏囊可引起严重免疫抑制。已知IBDV有两个血清型，即 血清1型和2型，仅1型对鸡有致病性，火鸡和鸭为亚临床感染，2型未发现有致病性。 本病具有特征性临床症状和眼观病变，可做出初步诊断，确诊应进行病原检测 2003年之后，国内外IBD诊断技术发展快速。一些更为简便和准确的诊断新技术已经成为IBD诊 断和预防的重要手段。本次对IBD诊断技术的修订，目的有二：一是与国际标准基本保持一致，改变国 家标准显著滞后于国际标准的状况；二是将一些在国内外经过多年实践证明成熟可行的新技术纳人进 来，改变原有标准中检测技术偏少且显著滞后于实际应用的状况。修订此标准，有利于我国IBD诊断 和预防，也有利于提升国家标准的权威性和实用性 本标准参考OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》（2016版），并结合我国相关技术研究新成果 进行修订。 Ⅱ GB/T19167—2020 传染性法氏囊病诊断技术 1范围 本标准规定了传染性法氏囊病临床诊断和实验室诊断的技术要求。 本标准适用于鸡传染性法氏囊病的诊断、检测、监测和流行病学调查。其中琼脂凝胶免疫扩散试 验、反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）、实时荧光反转录聚合酶链式反应（实时荧光RT-PCR）、病毒分 离等诊断方法适用于临床疑似样本的检测与病毒分离，琼脂凝胶免疫扩散试验方法还适用于免疫抗体 水平检测。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AGID：琼脂凝胶免疫扩散试验（Agargelimmunodiffusiontest) CEF：鸡胚成纤维细胞（Chickembryofibroblastcell) CPE：细胞病变（Cytopathiceffect) IBD：传染性法氏囊病（Infectiousbursaldisease） IBDV：传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus） PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline) PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction) RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction） Real-timeRT-PCR：实时荧光反转录聚合酶链式反应（Real-timereversetranscription-polymerase chain reaction) SPF：无特定病原体（Specificpathogenfree) TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸（Trihydroxymethylaminomethane-aceticacid- ethylene diaminetetra acetic acid) 4临床诊断 4.1流行病学 4.1.1 自然感染仅发生于鸡，各种品种的鸡都能感染 4.1.2主要发生于2周龄～15周龄的鸡，3周龄～6周龄的鸡最易感，而1周龄～3周龄鸡常呈现亚急 性或亚临床症状 4.1.3常呈急性发病，传播迅速，通常在感染后第3天开始死亡，5d～7d达到高峰，后快速下降。 1 GB/T19167—2020 4.2临床症状 4.2.1潜伏期为2d~3d。 4.2.2易感鸡群感染后发病突然，病鸡体温突然升高，病鸡出现腹泻，排出白色黏稠或水样稀便，病程 一般为1周左右。 4.2.3急性病鸡可在出现症状1d～2d后死亡，鸡群3d~5d达死亡高峰，以后逐渐减少。 4.2.4随着病程的发展，食欲废绝，颈和全身震颤，病鸡步态不稳，羽毛蓬松，精神委顿，卧地不动，呼吸 困难，泄殖腔周围的羽毛被粪便污染 4.2.5后期病鸡脱水严重，趾爪干燥，最后衰竭死亡。 4.3 剖检变化 4.3.1 严重者腿部和胸部肌肉有条索状或斑块状出血。 4.3.2法氏囊水肿和出血，体积增大，重量增加，严重者呈紫黑色、葡萄状；部分法氏囊出现菱缩。 4.3.3有些法氏囊淡黄色水肿 4.3.4肾肿大褪色，肾小管有尿酸盐沉积，呈红白相间“花斑肾”。 4.4 结果判定 符合上述流行病学特征、临床症状和剖检变化的病例，可以判为疑似IBD。确诊应采集有临床症状 动物的法氏囊等组织或血清进行实验室诊断。 实验室诊断样品采集 5.1器材 5.1.1手术剪刀和镊子。 5.1.2离心管。 5.1.3样品保存管。 5.1.4组织匀浆器。 5.1.5采血器。 5.2 2试剂 5.2.1 0.01mol/LpH7.2PBS,配方见附录A中A.1。 5.2.2青霉素。 5.2.3 链霉素。 5.3样品采集 5.3.1生物安全措施 按照GB19489的要求进行。 5.3.2组织病料采集 采集多只病鸡的法氏囊，分别装入样品保存管，密封、冷冻保存。 5.3.3血清样品采集 经翅静脉采集鸡血液，每只应不少于1mL。无菌分离血清，装入2mL离心管中，密封后2℃～8℃ 2 GB/T 19167—2020 冷藏或一20℃冷冻保存。 5.4样品处理 用剪刀剪碎法氏囊组织，加人含青霉素4000IU/mL和链霉素4000μg/mL的PBS，用组织匀浆 器制成20%匀浆，反复冻融2次～3次，10000r/min离心10min，取上清作为检测材料。 6琼脂凝胶免疫扩散试验（AGID） 6.1器材 6.1.137℃温箱。 6.1.2 烧杯（200mL）。 6.1.3搅拌棒。 6.1.4电磁炉。 6.1.5微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL等不同规格）。 6.1.6 灭菌平皿(9cm~15cm)。 6.1.7 打孔器（中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距4mm）。 6.2 试剂 6.2.1 标准IBD琼扩阳性抗原（参见附录B的B.1）。 6.2.2 标准IBD琼扩阴性抗原（参见B.2）。 6.2.3 标准IBDV阳性血清（参见B.3）。 6.2.4标准IBDV阴性血清(参见B.4)。c 6.2.5 琼脂糖。 6.2.6 0.01mmol/L磷酸缓冲液（pH7.4），配方见A.2。 6.2.7 氯化钠。 6.3 试验程序 6.3.1 琼脂平血制备 参见 B.5。 6.3.2打孔、封底 在制备好的琼脂板上用打孔器打孔，并挑出孔中的琼脂。中心1孔，周围6孔，孔径3mm，孔距 4mm，在火焰上封底。 6.3.3加样、孵育、观察 6.3.3.1病原检测 中央孔加入标准IBDV阳性血清，第1孔、第4孔分别加入标准IBD琼扩阳性抗原和标准IBD琼 扩阴性抗原，其他孔分别加入待检样品，20μL/孔。静置5min～10min，将加样后的平皿轻轻倒置放 入填有湿纱布的盒内，置于37℃温箱，在24h、48h观察并记录结果。 6.3.3.2抗体检测 中央孔加人标准IBD琼扩阳性抗原，第1孔、第4孔分别加人标准IBDV阳性血清和标准IBDV阴 性血清，其他孔分别加人待检样品；或第1孔加入标准IBD阳性血清，其他孔分别加人倍比稀释的待检 3 GB/T19167—2020 血清，20μuL/孔。静置5min～10min，将加样后的平皿轻轻倒置放人填有湿纱布的盒内，置于37℃温 箱，在24h、48h观察并记录结果。 6.4试验成立条件 24h，标准IBDV阳性血清与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间形成清晰沉淀线，标准IBDV阳性血清 与标准IBD琼扩阴性抗原孔之间未形成清晰沉淀线。 6.5结果判定 6.5.1病原检测 24h或48h，待检样品孔与标准IBDV阳性血清孔之间出现沉淀线，且与标准IBD琼扩阳性抗原 沉淀线末端相吻合时，待检样品判为阳性；标准IBD琼扩阴性抗原孔和待检样品孔与标准IBDV阳性 血清孔之间无沉淀线出现时，待检样品判为阴性（参见图B.1） 6.5.2抗体检测 待检血清孔与标准IBD琼扩阳性抗原孔之间出现沉淀线，且与标准IBDV阳性血清沉淀线末端相 为阴性（参见图B.2）。 标准IBD琼扩阳性抗原孔与待检血清之间形成清晰沉淀线的血清最高稀释倍数，即判为待检血清 琼扩效价。 7反转录聚合酶链式反应（RT-PCR) 7.1器材 7.1.1J PCR