ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 18638—2021 代替GB/T18638—2002 流行性乙型脑炎诊断技术 Diagnostic techniques for Japanese encephalitis 2021-10-01实施 2021-03-09发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T18638—2021 目 次 前言 引言 范围 规范性引用文件 3 缩略语 4 临床诊断 5 实验室诊断样品采集及处理 6 病毒分离鉴定 病毒RT-PCR检测方法 7 补体结合试验检测方法 血凝抑制试验检测方法 10 间接ELISA抗体检测方法 11 间接免疫荧光试验（IFA）检测方法 12病毒中和试验检测方法 13综合判定 16 附录A（规范性附录）病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制 17 附录C（规范性附录）补体结合试验检测方法的预备试验 20 附录D（资料性附录）补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图. ...23 附录E（规范性附录） 间接ELISA抗体检测方法试验用试剂配制 附录F（规范性附录） 间接免疫荧光试验（IFA）检测方法试验用试剂配制 26 GB/T18638—2021 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18638—2002《流行性乙型脑炎诊断技术》，与GB/T18638—2002相比，除编辑 性修改外，主要技术变化如下： 增加了“规范性引用文件”（见第2章）； 一增加了“缩略语”（见第3章）； 增加了“病毒RT-PCR检测方法”（见第7章）； 一增加了“间接ELISA抗体检测方法”（见第10章）； 增加了“间接免疫荧光试验（IFA检测方法”（见第11章）； 增加了“病毒中和试验检测方法”（见第12章）； 一增加了病毒RT-PCR检测方法试验用试剂配制（见附录A)； -增加了补体结合试验检测方法及血凝抑制试验检测方法结果判定示意图（见附录D）； 增加了间接ELISA抗体检测方法试验用试剂配制（见附录E)； 增加了间接免疫荧光试验（IFA）检测方法试验用试剂配制（见附录F）。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。 本标准起草单位：军事科学院军事医学研究院军事兽医研究所温州大学、华中农业大学、吉林 大学。 本标准主要起草人：金宁一、肖朋朋、鲁会军、曹胜波、黄少梅、张英、田明尧、李霄、李昌。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： GB/T18638—2002。 GB/T186382021 引言 流行性乙型脑炎（Japaneseencephalitis）又称日本乙型脑炎，是由流行性乙型脑炎病毒引起的一种 蚊媒性人兽共患传染病。马呈现脑炎症状，猪表现流产、死胎和睾丸炎，其他家畜和家禽大多呈隐性感 染。有明显的季节性，于夏、秋季多发。本病分布很广，主要存在亚洲地区，给人畜健康和国民经济造成 很大的危害和损失 引起本病的病原体为流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisuirus），该病毒属于黄病毒科 （Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus），是一种单股RNA病毒，病毒粒子呈球形，有脂蛋白的囊膜，具 有血凝活性，能凝集鸡、鸭、鹅及绵羊红细胞。该病毒对外界抵抗力不强，对化学药品较敏感，常用消毒 药都有良好的灭活作用，对胰酶、乙醚、三氯甲烷等亦敏感 世界动物卫生组织（OIE)推荐采用病毒分离鉴定、免疫荧光试验、血凝抑制试验、补体结合试验、血 清中和试验等方法进行诊断。我国对该病的研究报道较多，目前比较常用的诊断方法仍是本标准规定 的临床诊断、病毒分离鉴定、血凝抑制试验、补体结合试验、RT-PCR试验、间接ELISA试验、间接免疫 荧光试验和病毒中和试验。进行病毒分离鉴定时，要求所有样品处理应在可保证生物安全的相应级别 实验室内进行操作；处理样品使用过的容器、物品、实验材料均应经有效消毒处理后方可运离实验室。 本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准手册》2018版（ManualofDiagnostic TestsandVaccinesforTerrestrialAnimals，2018），并结合了我国相关技术研究新成果。本标准的实施， 对提高流行性乙型脑炎的诊断和疫情预测水平，及时采取防制措施，保证人畜健康，将起到重要作用 Ⅱ GB/T18638—2021 流行性乙型脑炎诊断技术 1范围 本标准规定了流行性乙型脑炎（Japaneseencephalitis，JE）的临床诊断和实验室诊断的技术要求。 本标准适用于猪、马、骤、驴、牛、羊、狗、鸭、鹅和鸟等动物的流行性乙型脑炎的诊断和检疫。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T18088出入境动物检疫采样 GB19489实验室生物安全通用要求 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BBS硼酸盐缓冲液（boratebufferedsaline） CFT补体结合试验（complementfixationtest） CPE 细胞病变效应（cytopathiceffect） DEPC 焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） DNA 脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTP 脱氧核糖三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） ELISA 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay） FITC 异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate） HRP 辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase） JEV 流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus） PBS 磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline） RNA 核糖核酸（ribonucleicacid) RT-PCR反转录-聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction） TCID50半数组织培养感染剂量（mediantissuecultureinfectivedose） 4临床诊断 4.1易感动物 猪、马、、驴、牛、羊、狗、鸭、鹅和鸟等多种动物均可被感染，其中猪的感染最为常见 4.2临床症状 4.2.1猪感染后出现发热，少数猪会出现神经症状。怀孕母猪可引起流产、产死胎，公猪出现辜丸肿大 4.2.2马感染后体温升高（39℃～41℃），出现神经症状（沉郁或狂躁不安），姿势异常，走路摇晃或转 圈，四肢呈游泳状态。 1 GB/T18638—2021 4.2.3 其他动物多为隐性感染，无明显临床症状。 4.3 病理变化 4.3.1 感染猪病理变化 4.3.1.1 流产胎儿脑水肿，皮下血样浸润，肌肉似水煮样，腹水增多 4.3.1.2 肝、脾、肾有坏死灶。 4.3.1.3 全身淋巴结出血，肺瘀血、水肿，子宫黏膜充血、出血和有黏液，胎盘水肿或见出血。 4.3.1.4 公猪睾丸实质充血、出血和小坏死灶，睾丸硬化，体积缩小，与阴囊粘连，实质结缔组织化 4.3.2 感染马病理变化 4.3.2.1 脑脊液增量，血管充血，脑膜下出血。 4.3.2.2 脑组织有不同形态的软化灶，脑神经细胞浓缩、变性、坏死，甚至有脱髓现象 4.3.2.3 呈小胶质细胞增生反应，并呈卫星现象一假嗜神经或嗜神经。 4.3.2.4 皮下组织轻度黄染，心冠脂肪胶样浸润，心内膜和心外膜有出血点，肾包膜下出血。 4.4 初步诊断 4.4.1 易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判定为疑似JEV感染。 4.4.2 确诊应采集样品进行实验室诊断。 5 实验室诊断样品采集及处理 5.1号 器材 5.1.1 组织研磨器。 5.1.2 G5级玻璃滤器。 5.1.3 孔径0.45μm的微孔滤膜 5.1.4 注射器（0.2mL和10mL）及针头。 5.1.5 离心管（1.5mL和10mL）。 5.1.6 医用防护服。 5.1.7 灭菌玻璃瓶（10mL）。 5.2试剂 5.2.1 汉克氏（Hank's）液 5.2.2 0.5%水解乳蛋白Hanks液。 5.2.3 20000IU/mL青霉素液。 5.2.4 20.000μg/mL链霉素液。 5.3 样品采集 5.3.1 生物安全措施 样品采集的生物安全措施符合GB/T18088的规定 5.3.2脑脊髓液样品采集 在流行性乙型脑炎流行早期和发病早期（即病毒血症阶段），无菌采集动物的脑脊髓液，每头应不少 2 GB/T18638—2021 于1mL，穿刺部位在两骼连线中点稍下方第七腰椎间隙。 5.3.3睾丸样品采集 采集种公病畜的异常（肿胀或萎缩）睾丸，切成小块，置于灭菌玻璃瓶。 5.3.4病死动物脑组织样品采集 应在病畜（包括流产死胎）死亡后3h内采取脑组织（选大脑皮质、脑干、中脑、海马回及桥脑）数小 块，置于灭菌玻璃瓶。 5.3.5血清样品采集 无菌采集病畜血液，每头应不少于5mL，无菌分离血清，装人离心管中，加盖密封后冷藏或冷冻 保存。 5.4样品处理 5.4.1 生物安全措施 样品处理的生物安全措施符合GB19489的规定。 5.4.2 组织样品处理 将采集的动物脑组织或罩丸组织在组织研磨器中充分研磨，加入青霉素500IU/mL和链霉素 500μg/mL，加人0.5%水解乳蛋白Hanks液，制成10%悬液，4℃浸泡3h~4h，3000r/min离心 30min，取上清液备用。 5.4.3怀疑有污染的样品，可用0.45μm微孔滤膜过滤法处理。 6 病毒分离鉴定 6.1 器材 6.1.1 25cm²细胞培养瓶。 6.1.2 吸管。 6.1.3 试管。 6.1.4 水浴箱。 6.1.5 恒温培养箱。 6.1.6 倒置显微镜。 6.2 试剂 6.2.1 7%碳酸氢钠液。 6.2.2 1%胰蛋白酶液。 6.2.3 1%酚红（中性）液。 6.2.4最低必要成分培养液（MEM）。 6.2.5 小牛血清。 6.3 试验动物与细胞 6.3.1 清洁级BALB/c小鼠（6g～8g）。 3