ICS11.020 C50 备案号：158602005 WS 中华人民共和国卫生行业标准 WS/T244—2005 血小板计数参考方法 Reference method for platelet counting 行业标准信息服务平台 2005-05-08发布 2005-12-01实施 中华人民共和国卫生部发布 PDF文件使用"pdfFactoryPro试用版本创建www.fineprint.cn WS/T244—2005 前 言 为了保证血小板的计数结果具有溯源性和准确性，特制定本标准。 本标准从2005年12月1日起实施。 本标准由卫生部提出。 本标准起草单位：卫生部临床检验中心。 本标准主要起草人：彭明婷、申子瑜、陆红、谷小林、杨振华。 本标准由卫生部负责解释。 行业标准信息服务平台 PDF文件使用"pdfFactoryPro试用版本创建www.fineprint.cn WS/T244—2005 血小板计数参考方法 1范围 本标准规定了血小板计数参考方法的技术要求。 本标准适用于血小板计数参考方法的建立。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 参考方法（Referencemethod） 一种可清楚和准确描述的用于特定检测的技术，该技术要有依据，可提供足够准确和精密的实验数 据以评价其他实验方法检测结果的有效性。若有决定性方法，参考方法的准确性必须与决定性方法进 行比较。参考方法应溯源至一级计量标准并且须标示不准确度和不精密度。 3总则 3.1本标准采用间接法计数血小板（Platelet，PLT）。即用荧光标记PLT后，用流式细胞仪检测红细 胞（Redbloodcell,RBC)和PI.T的比值，同时用单通道阻抗原理的半自动细胞计数仪准确计数RBC. 用RBC除以RBC和PLT的比值得出PLT的计数值。 3.2为了保证参考方法检测结果的精密度和准确性，建立参考方法的实验空必须进行比对。 4血小板计数参考方法的原理 首先将EDTA抗凝血标本用无菌缓冲液进行预稀释，再用特定的荧光抗体对PL.T进行染色。溶 液中已染色的血小板被稀释成计数浓度，用流式细胞仪检测血小板和红细胞，根据荧光强度和散射光强 度将阅值设在可从RBC中区分PLT的位置，以检测出RBC和PLT的比值。用RBC的计数值除以 RBC/PLT的比值计算出PLT计数值。 5血标本 5.1用合乎要求的塑料注射器或真空采血系统采集健康人的静脉血标本。 5.2标本的收集要求使用EDTA二钾为抗凝剂，抗凝剂的浓度为3.7至5.4umol/ml血（1.5~ 2.2mg/ml血)。 5.3盛有标本的试管应有足够的剩余空间以便于血标本的混匀操作。 5.4标本中不能有肉眼可见的溶血或小凝块。 5.5标本置于18℃~22℃室温条件下，取血后4小时之内完成检测。 5.6为了保证RBC和PLT分布的均一性，在预稀释和加标记抗体前动作轻柔地将采血管反复颠倒， 充分混匀标本。 6容器和器血 为避免血小板黏附于储存容器或稀释器血上，在标本检测的整个过程中必须使用聚丙烯或聚苯乙 烯容器，不得使用玻璃容器和器皿。 7仪器的性能 7.1使用流式细胞仪，通过前向角散射光和荧光强度来检测PLT和RBC。仪器在检测异硫氰酸荧光 1 PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.fineprint.cn WS/T244-2005 素标记的直径为2m的球形颗粒时必须有足够的敏感度 7.2用半自动、单通道、阻抗原理的细胞计数仪检测RBC.仪器小孔管的直径为80100m，小孔的长 度为直径的70%～100%，计数过程中吸人稀释标本体积的准确度在1%以内（溯源至国家或国际计量 标准）。 8试剂 8.1稀释液 用磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液.浓度为0.01mol/L，pH值7.2~7.4.含0.1%的牛血清白蛋白 （BSA）.配制方法如下： 8.1.1将1.15g无水磷酸氢二钠（NaHPO化学分析纯：分手量为142.0）加到约750ml去离子水或 蒸馅水中并使之溶解 8.1.2向210mg磷酸二氢钾 分析纯 为136.1）8.Og氯化钠（NaCl：化学分析 分村 为755）和.0OgBSA的混合物中加人 纯，分子量为58.44），200m K 纯分子员 去离子水或蒸馏水至1 条件 径在0. .25μm 8.1.3用低附着性的 间的滤膜过滤。 8.2染液 使用异硫氰酸变 标记的CD4和 CD6 抗体，这两种抗体可以与血小板膜糖蛋白Ⅱ/Ⅲ复合 物结合，用于检测量 号抗体是否能得到足够 染上荧光的血小板。抗体应能得到足够高的血小板的 实验室应确议 B FL1528nm处的荧光强度）对logFS（前向角散射光）的图形分析，将血小板从 荧光信号以便通进 噪声、碎片和RB 辨出来。 9 检测过程 9.1用加样器加 A 充分混匀（至少轻柔颠倒标本管8次）的血标本于100ml已过滤的PBS-BSA稀释 液中。 9.2加5ulCD41 15lCD61抗体染液，在室温18℃~22℃、避光条件下放置15分钟。 9.315分钟后，加 1PBS-BSA稀释液制备成1：1000的稀释标本，车轻颠到混匀以保证PLT 和RBC充分混匀。 9.4用流式细胞仪检测时 应多于 至少检测50 000。流式细胞仪的设定必 如果尚RBC散射光的信身和血小板的荧光信号应被视 须保证每秒计数少于300 号： 为RBC-PLT重叠，计数结果做分别计人RBC和PL.T 使用点图。检测过程中进荐使用正向置换移液器。 PEQ 10 RBC浓度的计数法 据中华人民共和国卫生行业标准WS/1-845-2005红细胞和白细胞计效参考方法 11血小板计数值的确定 使用流式细胞仪确定RBC/PLT的比值 R-RBC/PLT 用RBC数除以R值得到PLT计数值 12重叠 一旦设定了理想的检测条件，则不须再次进行重叠计数的校准。 PDF文件使用"pdfFactoryPro"试用版本创建www.fineprint.cn