SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4782—2017 出口食品及调味品中罂栗成分检测方法 实时荧光PCR法 Detection of Papaverin export food and condiment- Real time PCR method 行业标准信息服务平台 2017-05-12发布 2017-12-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4782—2017 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国安徽出人境检验检疫 局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海市质量监督检验技术研究院。 本标准起草人：杨捷琳、高琴、宗凯、刘洋、刘月明、吕蓉、李想、潘良文、何宇平。 行业标准信息服务平台 一 SN/T 4782—2017 出口食品及调味品中罂栗成分检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了食品及调味品中罂粟成分检测的实时荧光PCR方法。 本标准适用于食品及调味品中罂栗成分定性检测。本标准所规定方法的最低检出限（LOD）为 0.01%（质量分数）。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 SN/T1193基因分析检测实验室技术要求 3术语和定义 下列术语及定义适用于本文件 3.1 罂栗 PapaversomniferumL. 按《中国植物志》，特指鸦片罂粟，为一种直立的一年生罂粟属草本植物 4方法提要 本标准采用实时荧光PCR特异性检测食品及调味品中罂粟成分。设计了针对罂栗小檗碱桥酶基 因的特异性引物探针，采用Taqman实时荧光方法进行检测。 5试剂和材料 5.1引物及探针（罂粟小檗碱桥酶基因Papaversomniferumberberinebridgeenzymebbel)： 上游引物：5'-GTTCTTAGGCTTACACTTGGGACG-3； 下游引物：5'-ACCGGGCTGTTCTGATAACATCT-3； 探针:FAM-TTTCAAGAAATGAGTTGGGGTGAATCC-BHQ1。 5.2石油醚。 5.3CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Na,EDTA, pH8.0。 5.4蛋白酶K(20mg/mL）。 5.5 三氯甲烷（氯仿）。 5.6 CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/LNaCl。 1 SN/T 4782—2017 5.7 71.2 mol/L NaCIl溶液。 5.8异丙醇。 5.970%乙醇。 5.10质控物质：罂粟阳性物质。 6仪器和设备 6.1 实时荧光PCR仪。 6.2恒温水浴锅。 6.3均质器。 6.4涡旋震荡器。 6.5离心机：最大转速16000g。 6.6移液器：2.5μL、20μL200μL、1000μL。 6.7核酸浓度测定仪。 6.8 3大体积浓缩仪。 7检验步骤 7.1样品前处理 7.1.1一般样品 取25g样品，研磨均质，称取200mg样品至2mL离心管中，按照步骤7.2提取DNA。 7.1.2高油脂含量样品 称取250g样品（预包装产品可加热溶解），倒人500mL烧杯中，静置1h～2h，样品可分为3层， 上层是油脂，中间是水相，下层是固体残渣。去除上层油脂，吸取水相到分液漏斗中，加入100mL石油 醚（5.2），震荡5min后静置，收集下层水相。采用大体积浓缩仪，40℃～60℃抽真空及低速离心条件 下，将水相浓缩至1mL～5mL。取浓缩后水相与固体残渣混合，转移到100mL烧杯中，研磨均质，取 200mg到2mL离心管中，采用7.2方法提取DNA。 7.2DNA提取 按照下述CTAB法提取DNA，也可采用等效的DNA提取试剂盒 在样品中加人1mLCTAB提取缓冲液（5.3）和20μL蛋白酶K（5.4）溶液，混匀，65℃水浴1h。 10000g离心10min，取上清转移至2mL离心管中，加人700uL氯仿（5.5），涡旋震荡30s混匀。 10000g离心10min，收集上清至新的2mL离心管中，加入2倍体积的CTAB沉淀液（5.6），室温放置 60min。10000g离心10min，弃上清。沉淀溶于350μL1.2mol/LNaCl溶液（5.7），涡旋震荡30s溶 解沉淀。加人350uL氯仿，涡旋震荡30s混匀，10000g离心10min。将上清转移至新的离心管中，加 入0.8倍体积的异内醇（5.8），室温放置25min。10000g离心10min，弃上清，加人500uL70%乙醇 （5.9）洗涤沉淀。涡旋震荡30s，10000g离心10min，弃上清，室温干燥10min，加人50μL～80L无 菌水溶解DNA。 提取的DNA用核酸浓度测定仪测定浓度后，调整DNA浓度至20ng/μL～100ng/μL之间。 2