SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3932—2014 出口食品中蜡样芽孢杆菌快速检测方法 实时荧光定量PCR法 Rapid detection of Bacillus Cereus for export foods- Real-timePCRmethod 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3932—2014 前言 本标准依照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、上海交通大学、中华人民共和国湖北出 人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局 本标准起草人：杨捷琳、施春雷、谌鸿超、曾宪东、杨柳、贾俊涛、何宇平、潘良文、张继伦、姜英辉。 行业标准信息服务平台 SN/T3932—2014 出口食品中蜡样芽抱杆菌快速检测方法 实时荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了出口食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光定量PCR检测方法。 本标准适用于出口食品中蜡样芽抱杆菌的快速检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.14食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验 3测定方法 3.1方法提要 本标准采用锁核苷酸（LNA）探针特异性检测蜡样芽孢杆菌。该探针利用了单核苷酸多态性 （SNP，SingleNucleotidePolymorphism）的原理，利用蜡样芽孢杆菌区别于其他种芽孢杆菌的特异位点 进行检测。 3.2试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂水为无菌双蒸水。 3.2.1引物： 5'-CCTTCTTCAAGTTCAAATCTCG-3 5'-GTYGTAATGACAGGTGATGGA-3 3.2.2锁核苷酸（LNA)探针： 注：表示该位点为锁核苷酸位点 3.2.3 Taq DNA 聚合酶。 3.2.4dNTP:dATP,dTTP、dCTP、dGTP。 3.2.5DNA提取试剂：0.1%Chelex100水溶液。 3.2.6 10XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4），200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。 3.2.7LB培养基：称取酪蛋白陈10g，酵母提取物5g，NaCl10g，溶于1L水中，调节pH值至7.0,高 压灭菌。 3.2.8蜡样芽孢杆菌质控菌株：ATCC14579或等效菌株。 3.3仪器和设备 3.3.13 荧光PCR仪。 3.3.2 2离心机：20000r/min。 1 SN/T 3932—2014 3.3.3 移液器：2.5μL、20μL、200μL1000μL。 3.3.4水浴锅。 3.4检验步骤 3.4.1增菌 3.4.1.1冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃~5℃不超过18h解冻，若不能及时检验，应 放于一18℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰 箱保存，24h内检验。 3.4.1.2称取样品25g，放人盛有225mLLB培养基（见3.2.7）的无菌均质杯内，用旋转刀片式均质器 以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mLLB培养基的无菌均质袋中，用 拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mLLB培养基的无菌锥 形瓶（瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠）中，振荡混匀，作为1：10的样品匀液。根据对样品污染状况 的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）30℃1℃，培养9h～18h。 3.4.2模板DNA准备 每瓶培养的菌液分别取1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清： 加人50μLTE溶液及终浓度为3mg/mL的溶菌酶，室温孵育10min，孵育完毕后沸水浴5min（也可 验，可将上清液于一20℃保存）。 3.4.3荧光PCR检测 3.4.3.1反应体系总体积为25μL，其中含：10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(10mmol/L)1μL、引物对 (10μmol/L)各1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL、探针（2μmol/L)1μL、水15.5μL、模板DNA 2.5μL。反应条件：95℃10min；95℃15s，60℃1min，60℃时收集FAM荧光，共进行40个循环。反 应产物可在4℃保存，必要时可进行电泳或测序等确证工作。 3.4.3.2检测过程中分别设阳性对照、阴性对照，阳性对照（3.2.8）为标准菌株基因组DNA或是扩增 片断的阳性克隆，阴性对照以2.5uL无菌水作为模板 3.5结果与报告 3.5.1阳性对照C，值<30，阴性对照无扩增时，该检测结果有效。检测样本C，值小于或等于35.0时， 报告蜡样芽孢杆菌筛选阳性；检测样本C，值大于35.0且小于40.0时，重复一次·如果C，值仍小于 40.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告蜡样芽孢杆菌筛选阳性，否则报告蜡样芽抱杆菌未检出；样品 检测无明显扩增曲线时，报告蜡样芽孢杆菌未检出。 3.5.2阳性样本按GB/T4789.14进行确证。 3.5.3报告每25g样品中检出或未检出蜡样芽孢杆菌。 3.6废弃物处理和防止污染的措施 收集检测过程中的废弃物，经121℃高压处理后丢弃。