SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3888—2014 入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌 快速检测方法 Rapid detection of Yersinia pestis from entry-exit animal skins 行业标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3888—2014 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国内蒙古出入境检验检疫局、中华人民共和国珠海出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人：乔舜、魏怀波、田丽、葛润平、郭文霞、王东胜、郝广福、张胜。 行业标准信息服务平台 一 SN/T 3888—2014 入出境动物皮张携带鼠疫耶尔森氏菌 快速检测方法 1范围 本标准规定了入出境动物皮张携带鼠疫杆菌的样本采样、保存及反相间接血凝试验和聚合酶链反 应试验的快速检测方法。 本标准适用于人出境旱獭、狐狸、狼、猪、鼠、灰鼠等可能感染鼠疫杆菌的动物皮张及寄生物的 病原体检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 WS279鼠疫诊断标准 国务院令第424号病原微生物实验室生物安全管理条例 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 动物皮张animalskins 可能携带鼠疫杆菌的旱獭皮、狐狸皮、狼皮、猪皮、麝鼠皮、灰鼠皮等。 标准信息 4实验室条件及防护要求 4.1准则 检测标本的处理和保存应在BSL-2级以上实验室中进行。BSL-2级以上实验室的要求要符合 GB19489和《病原微生物实验室生物安全管理条例》中同级别实验室的要求，并按照以上两个文件的要 求来进行个人防护。检测方法主要参考WS279。 4.2个人防护 采用实验室二级防护标准。 4.3 实验仪器设备 生物安全柜、DNA扩增仪、凝胶成像分析系统、电泳仪、高压灭菌器、电子天平、水浴锅、恒温箱、 V孔板、移液器、不锈钢剪刀、打孔器 1 SN/T 3888—2014 5样本的采集和保存 5.1梳检寄生物 5.2取样部位 选择待检皮张的头颈部、尾部、四肢各个部位，有血液、淋巴结附着部位优先采样。 5.3取样方法 每张皮张按头颈部、四肢、尾部不同部位分别取1cm²大小的样本6块，用10cm×15cm塑料封口 袋保存；血渍、淋巴结的部位用刀片刮取血渍，于10mL带盖离心管内保存 5.4样本存放 采集到的样本放置于一20℃冰柜或低温冰箱中冷冻保存，待检。 5.5样本处理 5.5.1反相间接血凝试验（Reverseindirecthemagglutinationassay，RIHA）样品处理方法 粉碎样本，加生理盐水浸没，浸泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min，吸取上清液，56℃灭 活30min后制成样液，备检。 5.5.2.1取1g龙胆紫，先用2mL酒精溶解后，加蒸馏水至100mL，混匀，取此溶液10mL加人 90mL蒸馏水制备成1g/L龙胆紫液；取2gNaCl加人100mL蒸馏水中，取此液100mL加入1g/L 龙胆紫液0.5mL，混匀后，分装高压灭菌30min，配制成洗蚤液备用。 5.5.2.2粉碎样本，用双蒸水浸没，浸泡24h。吸取浸泡液1500r/min离心5min，吸取上清液，56℃ 灭活30min后制成样液，备检：蚤、蜱，螨等寄生物样本置于研蚤板U孔内，用洗蚤液反复清洗干净，弃 去清洗液，研磨后用生理盐水按照100μL/只蚤（螨）、500μL/只蜱比例制成悬液，1500r/min离心 信息服务平台 5min，吸取上清液，56℃灭活30min后制成样液，备检 6检测方法 6.1反相间接血凝试验（RIHA) 6.1.1试剂 6.1.1.11%鼠疫F1抗体致敏血球。 6.1.1.2抑制剂为1：100稀释的鼠疫免疫血清。 6.1.1.3阳性对照血清：阴性混合血清加F1抗原至1mg/mL,1：100稀释后作为阳性对照 6.1.2标本准备 按照5.5.1准备标本。 2