SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3767.24—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第24部分：水稻LLRICE62品系 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 24:Rice LLRICE62 标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3767.24—2014 前言 SN/T3767《出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法》共分为30部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：筛选方法； 第3部分：玉米Bt-11品系； 第4部分：玉米Bt176品系； 第5部分：玉米GA21品系； 第6部分：玉米MIR162品系； 第7部分：玉米MIR604品系； 第8部分：玉米MON810品系； 第9部分：玉米MON863品系； 第10部分：玉米MON88017品系； 第11部分：玉米MON89034品系； 第12部分：玉米T-25品系； 第13部分：玉米3272品系； 第14部分：玉米59122品系； 第15部分：大豆A2704-12品系； 第16部分：大豆A5547-127品系； 第17部分：大豆DP356043品系； 第18部分：大豆GTS40-3-2品系； 第19部分：大豆MON89788品系； 业标准信息服务平台 第20部分：水稻Bt-63品系； 第21部分：水稻KF6品系； 第22部分：水稻KF8品系； 第23部分：水稻KMD品系； 第24部分：水稻LLRICE62品系； 第25部分：水稻M12品系； 第26部分：水稻T1C-19品系； 第27部分：水稻T2A-1品系； 第28部分：小麦B73-6-1品系； 第29部分：甜菜H7-1品系； 第30部分：油菜RT-73品系。 本部分为SN/T3767的第24部分。 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国珠海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人：贺艳、刘伟、赵卫东、黄新、郑文杰、张裕君、陈颖、冯家望、李志勇、刘津、凌莉、 石磊。 I SN/T 3767.24—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第24部分：水稻LLRICE62品系 1范围 (LAMP)初筛检测方法。 本部分适用于进出口的稻谷和大米中转基因水稻LLRICE62品系特异性的定性检测。 本方法的定性检测低限为0.5%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T2584水稻及其产品中转基因成分检测实时荧光PCR法 SN/T3767.2—2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法第2部分：筛 行业标准 选方法 3防污染措施 信息服务平台 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 4抽样与制样 按照GB/T19495.7的规定执行。 5核酸提取纯化 按照GB/T19495.3的规定执行。 6LAMP检测方法 6.1原理 6.1.1一般原理 根据转基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内引物、外引物和成环引物 1 SN/T 3767.24—2014 各一对，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利 用Bst酶启动循环链置换反应，在水稻品系LLRICE62特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互 补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反 判定结果。 6.1.2显色液显色原理 在LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子，未发生反应时锰离子与钙黄绿素结合， 钙黄绿素的荧光被萍火，呈现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结 合，形成不可逆的沉淀物，将锰离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镁 离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧 光，颜色也由橙色转为绿色。 6.2仪器和设备 6.2.1元 超纯水发生器。 6.2.2水浴锅或加热模板：63.0℃±0.5℃和80.0℃土0.5℃。 6.2.3 离心管：0.1mL、1.5mL 6.2.4 移液器：量程0.5μL～10μL；量程10μL~100μL；量程100μL～1000μL。 6.2.5 5计时器。 6.3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.3.2dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.3.3BstDNA聚合酶：酶浓度8U/μL，建议采用NEB的Bst酶，或者具有同等效力的酶。 6.3.410 ThermolPol 缓冲液：含200 mmol/L Tris-HCl(pH值为 8.8）、100 mmol/L硫酸铵、 100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.5硫酸镁溶液：50mmol/L 6.3.6 甜菜碱：5mol/L。 6.3.7 显色液：钙黄绿素荧光染料，0.312mol/L。 6.3.8引物：根据转基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外 引物1(F3)，外引物2(B3)，内引物1(FIP)、内引物2(BIP)和环引物1(FLP）环引物2(BLP)。 外引物扩增片段长度为226bp，序列信息见附录A。 内引物1(FIP,5’-3’):AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGAAACCAGGTGGACTAAAAGT 内I物2BIP,5-3:GCGAAAGGGGGATGTGCTGTGACTGGGAAAACCCTG 环引物1(FLP,5’-3’）:CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC 外引物1(F3,5’-3）：TGTAACACGCACACTCAC 外引物2(B3,5’-3'）：CTGGCCGTCGTTTTACAA 6.4实验步骤 6.4.1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置 6.4.1.1 阴性对照： 2