SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3767.22—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第22部分：水稻KF8品系 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 22:Rice KF8 标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3767.22—2014 前言 SN/T3767《出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法》共分为30部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：筛选方法； 第3部分：玉米Bt-11品系； 第4部分：玉米Bt176品系； 第5部分：玉米GA21品系； 第6部分：玉米MIR162品系； 第7部分：玉米MIR604品系； 第8部分：玉米MON810品系； 第9部分：玉米MON863品系； 第10部分：玉米MON88017品系； 第11部分：玉米MON89034品系； 第12部分：玉米T-25品系； 第13部分：玉米3272品系； 第14部分：玉米59122品系； 第15部分：大豆A2704-12品系； 第16部分：大豆A5547-127品系； 第17部分：大豆DP356043品系； 第18部分：大豆GTS40-3-2品系； 第19部分：大豆MON89788品系； 业标准信息服务平台 第20部分：水稻Bt-63品系； 第21部分：水稻KF6品系； 第22部分：水稻KF8品系； 第23部分：水稻KMD品系； 第24部分：水稻LLRICE62品系； 第25部分：水稻M12品系； 第26部分：水稻T1C-19品系； 第27部分：水稻T2A-1品系； 第28部分：小麦B73-6-1品系； 第29部分：甜菜H7-1品系； 第30部分：油菜RT-73品系。 本部分为SN/T3767的第22部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共 和国广东出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈颖、邓婷婷、黄文胜、吴亚君、李新实、傅凯、韩建勋、王斌、胡玥、陈文炳、李志勇 I SN/T 3767.22—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第22部分：水稻KF8品系 1范围 (LAMP)初筛检测方法。 本部分适用于稻谷和大米中转基因水稻KF8品系特异性的定性检测。 本方法的定性检测低限为0.5%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T3767.2一2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP)检测方法 第2部分：筛 行业标 选方法 3防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 信息服务平台 4抽样与制样 按照GB/T19495.7的规定执行。 5核酸提取纯化 按照GB/T19495.3的规定执行。 6LAMP检测方法 6.1原理 6.1.1一般原理 根据转基因水稻KF8品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内、外引物各一对（特异性目标序 1 SN/T 3767.22—2014 列和引物碱基序列参见附录A），特异性识别目标序列上的六个独立区域，并设计一对环引物提高反应 效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反 应，在特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形 成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 6.1.2显色液显色原理 在LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子，未发生反应时锰离子与钙黄绿素结合， 钙黄绿素的荧光被率火，皇现橙色。当扩增反应发生时，扩增过程中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结 合，形成不可逆的沉淀物，将锰离子从钙黄绿素上释放下来，从而使钙黄绿素恢复荧光，同时体系中的镁 离子与钙黄绿素结合，进一步加强钙黄绿素的荧光，可在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧 光，颜色也由橙色转为绿色。 6.2仪器和设备 6.2.1 超纯水发生器。 6.2.2 水浴锅或加热模板：65.0℃±0.5℃和80.0℃土0.5℃。 6.2.3 离心管：0.1mL1.5mL。 6.2.4 移液器：量程0.5μL~10μL，量程10μL~100μL；量程100μL～1000μL。 6.2.5 5计时器。 6.3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.3.2 dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.3.3BstDNA聚合酶（如：NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶）：酶浓度8U/μL。 准信息服 6.3.410ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH值为8.8）、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L 氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.5石 硫酸镁溶液：50mmol/L。 6.3.6甜菜碱：5mol/L。 6.3.7显色液：钙黄绿素（Calcein）。 6.3.8引物：根据转基因水稻KF8品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物，包括外引物1， 外引物1(F3,5’-3):GCAAATATCTGACCCTGCAGACTGG 外弓I物2(B3,5-3):CCCTGGCGTTACCCAACTTA 内引物1(FIP,5’-3'):TGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGTGCCATCAAGATGCCAGA CCTGATAGT 内引物2(BIP,5’-3'):AACTGTTGGGAAGGGCGATCGATCGCCTTGCAGCACATCC 环引物1(FLP,5²-3’）:CGTTTCCCGCCTTCAGTTTAA 2