SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3767.8—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第8部分：玉米MON810品系 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 8:Maize MON810 标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3767.8—2014 前言 SN/T3767《食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP)检测方法》共分为30部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：筛选方法； 第3部分：玉米Bt-11品系； 第4部分：玉米Bt176品系； 第5部分：玉米GA21品系； 第6部分：玉米MIR162品系； 第7部分：玉米MIR604品系； 第8部分：玉米MON810品系； 第9部分：玉米MON863品系； 第10部分：玉米MON88017品系； 第11部分：玉米MON89034品系； 第12部分：玉米T-25品系； 第13部分：玉米3272品系； 第14部分：玉米59122品系； 第15部分：大豆A2704-12品系； 第16部分：大豆A5547-127品系； 第17部分：大豆DP356043品系； 第18部分：大豆GTS40-3-2品系； 第19部分：大豆MON89788品系； 业标准信息服务平台 第20部分：水稻Bt-63品系； 第21部分：水稻KF6品系； 第22部分：水稻KF8品系； 第23部分：水稻KMD品系； 第24部分：水稻LLRICE62品系； 第25部分：水稻M12品系； 第26部分：水稻T1C-19品系； 第27部分：水稻T2A-1品系； 第28部分：小麦B73-6-1品系； 第29部分：甜菜H7-1品系； 第30部分：油菜RT-73品系。 本部分为SN/T3767的第8部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人：王小玉、邝筱珊、冯家望、刘津、李志勇、胡松楠、游淑珠、曾静、薛峰、陈敬、 刘李登、常彦磊 I SN/T 3767.8—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第8部分：玉米MON810品系 1范围 SN/T3767的本部分规定了玉米及其加工产品中转基因玉米MON810品系特异性的环介导等温 扩增(LAMP)初筛检测方法。 本部分适用于玉米及其加工产品中转基因玉米MON810品系特异性的定性检测。 本方法的定性检测低限为0.5%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T2268转基因植物品系特异性检测方法 SN/T3767.2一2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP)检测方法第2部分：筛 选方法 3防污染措施 信息服务平台 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 4抽样与制样 按照GB/T19495.7的规定执行。 5核酸提取纯化 按照GB/T19495.3的规定执行。 6LAMP检测方法 6.1原理 6.1.1一般原理 根据转基因玉米MON810品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对并添 1 SN/T3767.8—2014 加一对环引物，特异性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立 区域，在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反 应，在特异自标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎 环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg?+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形 成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。在反应混合体系中不应存在DNA聚合 酶的抑制剂。在设置合适对照和在检测下限的情况下，定性检测结果可清楚判断样品是否为转基因 产品。 6.1.2显色液显色原理 SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它 与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的 荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光 信号也随之天幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。 6.2仪器和设备 6.2.1超纯水发生器。 6.2.2水浴锅或加热模板：63.0℃±0.5℃和80.0℃±0.5℃。 6.2.3 离心管：0.1mL、1.5mL。 6.2.4移液器：量程0.5μL~10μL；量程10μL100μL；量程100μL~1000μL。 6.2.5计时器。 6.3试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.3.2dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L。 6.3.3BstDNA聚合酶（如：NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶）：酶浓度8U/uL。 6.3.410ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTrisHCl（pH值为8.8）、100 mmol/L硫酸铵、 6.3.5硫酸镁溶液：150mmol/L。 6.3.6甜菜碱：5mol/L。 6.3.7显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000。 6.3.8引物：根据转基因玉米MON810品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引 物1，外引物2，内引物1和内引物2,环引物1和环引物2。 外引物扩增片段长度：192bp 外引物扩增片段长度：228bp 外引物2(B3,5-3）:GCAAGCAAATTCGGAAATGA 内引物1(FIP,5-3,):GCCAGAGGGAACCAGTACCGATTTACCTGATCCGCTACAA 内引物2(BIP,5′-3’):AAGTGTGCCCACCACAGCGAAAGTCCTCGTTCAGGTC 环引物1(FLP,5’-3’）：TTGACGGTCTCGTGCTTG 2