SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3767.6—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第6部分：玉米MIR162品系 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 6:Maize MIR162 标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3767.6—2014 前言 SN/T3767《出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法》共分为30部分： 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：筛选方法； 第3部分：玉米Bt-11品系； 第4部分：玉米Bt176品系； 第5部分：玉米GA21品系； 第6部分：玉米MIR162品系； 第7部分：玉米MIR604品系； 第8部分：玉米MON810品系； 第9部分：玉米MON863品系； 第10部分：玉米MON88017品系； 第11部分：玉米MON89034品系； 第12部分：玉米T-25品系； 第13部分：玉米3272品系； 第14部分：玉米59122品系； 第15部分：大豆A2704-12品系； 第16部分：大豆A5547-127品系； 第17部分：大豆DP356043品系； 第18部分：大豆GTS40-3-2品系； 第19部分：大豆MON89788品系； 业标准信息服务平台 第20部分：水稻Bt-63品系； 第21部分：水稻KF6品系； 第22部分：水稻KF8品系； 第23部分：水稻KMD品系； 第24部分：水稻LLRICE62品系； 第25部分：水稻M12品系； 第26部分：水稻T1C-19品系； 第27部分：水稻T2A-1品系； 第28部分：小麦B73-6-1品系； 第29部分：甜菜H7-1品系； 第30部分：油菜RT-73品系。 本部分为SN/T3767的第6部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人：陈双雅、刘津、高东微、李志勇、王嘉鹤、陈伟玲、王群力、谢明星、刘棠、彭小莉、 许秋贝。 I SN/T 3767.6—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第6部分：玉米MIR162品系 1范围 SN/T3767的本部分规定了转基因玉米MIR162品系特异性的环介导等温扩增（LAMP）初筛检测 方法。 本部分适用于玉米中转基因玉米MIR162品系特异性的定性检测。 本方法的定性检测低限为0.5%（质量分数）。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T3767.2一2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法第2部分：筛 选方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件 4F 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定 5# 抽样与制样 按照GB/T19495.7的规定执行。 6核酸提取纯化 按照GB/T19495.3的规定执行。 1 SN/T 3767.6—2014 7LAMP检测方法 7.1原理 7.1.1一般原理 根据转基因玉米MIR162品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物和外引物各一对，特异 性目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，在反应缓冲液 中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在Bst聚合酶的作用下启动循环链置换反应，在玉米MIR162品 系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环 乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 7.1.2显色液显色原理 SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它 与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的 荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光 信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。 7.2仪器和设备 7.2.15 超纯水发生器。 7.2.3离心管:0.1mL、1.5mL 7.2.4移液器：量程0.5μL10μL，量程10μL～100μL；量程100μL~1000μL。 7.2.5计时器。 7.3试剂和材料 7.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 7.3.2dNTPs溶液：每种核苷酸浓度10mmol/L。 7.3.3 BstDNA聚合酶（如：NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶）：酶浓度8U/μuL。 7.3.4 10ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH值为8.8）、100 mmol/L硫酸铵、 100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 7.3.5硫酸镁溶液：100mmol/L。 7.3.6甜菜碱：5mol/L。 7.3.7显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000。 7.3.8引物：根据转基因玉米MIR162品系外源基因和玉米边界序列设计一套特异性引物，包括外引 物1，外引物2，内引物1和内引物2。 外引物扩增片段长度：214bp 外引物1(F3,5-3'):TGATTAGAGTCCCGCAATT 外引物2(B3,5'-3'）：TCATACAAAAAGGCCCAGT 内引I物1(FIP,5’-3'):AACATAGATGACACCGCGCG-GCGATAGAAAACAAAATATAGCG 内引物2(BIP,5′-3'):ATTCAGTACATTAAAAACGTCCGCC-AAAACAACTACCACAAGGC 2