SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3730.8—2013 食品及饲料中常见畜类品种的 鉴定方法 第8部分：猪成分检测 实时荧光PCR法 Identification of domestic animal ingredient in food and feed- Part 8 :Detection of pig ingredient—Real-time PCR method 业标准信息服务平台 2013-11-06 发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3730.8—2013 前 言 SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分： 第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：狗成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：狐狸成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法； 第5部分：马成分检测实时荧光PCR法； 第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法； 第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法； 第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3730的第8部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本部分主要起草人：高宏伟、林超、孙敏、刘彩霞、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷 行业标准信息服务平台 SN/T 3730.8—2013 食品及饲料中常见畜类品种的 鉴定方法第8部分：猪成分检测 实时荧光PCR法 1范围 SN/T3730的本部分规定了畜肉食品中猪成分检测方法。 本部分适用于食品及饲料中猪组织成分的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪 Sus 3.2 实时荧光PCR realtimePCR 息服务平台 在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。 3.3 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl）aminomethane） EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu） OD：光密度值（opticaldensity） 1 SN/T3730.8—2013 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用猪线粒体atp8基因特异性检测引物和探针进行实 时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否存在猪成分。 6试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物（对）序列和探针：猪成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见 表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5"-3"） 目的基因 内参照5端引物 F:5-TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA-3 真核生物 内参照3端引物 R:5-AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT-3 18SrRNA基因 内参照探针 P:5-FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACC-TAMRA-3 猪成分5端引物 F:ATCTACATGATTCATTACAATTAC-3 猪线粒体 猪成分3'端引物 R:CTATGTTTTTGAGTTTTGAGTTCA-3 atp8基因 猪成分探针 P:5-FAM-ATCTCAAACTACTCATACCCA-TAMARA-3 6.2CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB,1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris,用 10%盐酸调pH至8.0，121℃高压灭菌20min，备用。 标准信息服务平台 6.3TE缓冲液(Tris-Cl,EDTA缓冲液）:10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)。 6.4蛋白酶K:20mg/μL。 6.5 RNA酶溶液：5μg/μL。 6.6 Tris饱和酚。 6.7 三氯甲烷。 6.8 异戊醇。 6.9 异丙醇。 6.10 70%乙醇。 6.11 Taq DNA聚合酶。 6.12 dNTP混合液。 6.13 10XPCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4),200 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl 仪器和设备 7.1实时荧光PCR仪。 7.2离心机：最大离心力≥16000g。 7.3微量移液器:1μL~10μL5μL~100μL、5μL~200μL、20μL~1000L。 7.4冰箱:2℃~8℃，-20℃。