SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3730.3—2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第3部分：狐狸成分检测 实时荧光PCR法 Identification of domestic animal ingredient in food and feed- Part 3:Detection of fox ingredientReal-time PCR method 行业标准信息服务平台 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3730.3—2013 前言 SN/T3730《食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法》共分为以下8个部分： 第1部分：貂成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：狗成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：狐狸成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：驴成分检测实时荧光PCR法； 第5部分：马成分检测实时荧光PCR法； 第6部分：猫成分检测实时荧光PCR法； 第7部分：水牛成分检测实时荧光PCR法； 第8部分：猪成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3730的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分主要起草人：孙敏、林超、高宏伟、刘彩霞、陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。 行业标准信息服务平台 I SN/T 3730.3—2013 食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法 第3部分：狐狸成分检测实时荧光PCR法 1范围 SN/T3730的本部分规定了食品和饲料中狐狸成分的实时荧光PCR鉴定方法。 本部分适用于食品及饲料中狐狸成分的定性检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 狐狸fox 属哺乳纲，食肉目，犬科（Canidae），狐亚科（Vulpini）。除包括狐属（Vulpes）动物外，狐狸还包括狐 亚科其他属的动物：倭狐属（Fennecus）、大耳狐属（Otocyon）、南美狐属（Dusicyon）、灰狐属（Urocyon） 北极狐属（Aloper）和食蟹狐属（Cerdo-cyon）。 3.2 实时荧光PCRrealtimefluorescentPCR 在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。 息服务平台 3.3 Ct 值cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyltrimethylammoniumbromide） EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu） FAM：羧基荧光素（carboxyfluorescein） TAMRA：羧基四甲基罗丹明（carboxy-tetramethyl-rhodamine） 1 SN/T3730.3—2013 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane] 5方法提要 利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA；以提取的DNA为模板，采用 特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，根据Ct值，判断样品中是否含有狐狸成分。 6试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。所有试 剂均用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物（对）和探针序列：狐狸成分扩增引物和探针、内参照（真核生物成分）引物和探针详见 表1。 表1试验用引物和探针 名称 序列（5"-3"） 目的基因 内参照5端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 内参照3°端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 真核生物18SrRNA基因 内参照探针 FAM-CCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCTAMRA 狐狸5端引物 TGGAGCATCAGTAGACCTTACAATTT 狐狸线粒体细胞色素氧化 狐狸3'端引物 GGCGGGAGGTTTTATATTGATAATAG 酶I亚基基因 狐狸探针 FAM-CCCTGCACCTGGCCGGAGTC-TAMRA 6.2CTAB缓冲液:55mmol/LCTAB.1400mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA,100mmol/LTris,用 10%盐酸调pH至8.0，121℃，高压灭菌20min.备用。 6.3TE缓冲液（Tris-Cl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl(pH8.0），1mmol/LEDTA，体积分数 2%PVP，pH8.0，高压灭菌。 6.410XPCR缓冲液:200 mmol/LTris-HCl(pH8.4）,100 mmol/LKCl,20 mmol/LMgSO4， 息服务平台 160 mmol/L (NH),SO4,1% Triton X-100,1 mg/mL BSA。 6.5蛋白酶K溶液20mg/mL。 6.6RNA酶溶液:10μg/μL。 6.7 Tris饱和酚。 6.8 三氯甲烷。 6.9 异戊醇。 6.10 异丙醇。 6.11 70%乙醇。 6.12 Taq DNA聚合酶。 6.13 dNTP混合液。 1 仪器和设备 7.1均质器（可拆卸、可清洗、可高压灭菌）或研钵。 2