SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3729.10—2013 出口食品及饮料中常见 水果品种的鉴定方法 第10部分：香蕉成分检测 实时荧光PCR法 Identification of fruit species in export food and drink- Part 1O:Detection of banana ingredient Real-time PCR method 准信息服务平台 2013-11-06 发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3729.10—2013 前言 SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分： 第1部分：草莓成分检测PCR法； 第2部分：杏成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：梨成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：芒果成分检测 实时荧光PCR法； 第5部分：木瓜成分检测 实时荧光PCR法； 第6部分：苹果成分检测 实时荧光PCR法； 第7部分：葡萄成分检测 PCR法； 第8部分：山楂成分检测 实时荧光PCR法； 第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法； 第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3729的第10部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出人境检验检疫局 本部分主要起草人：张舒亚、叶军、于翠、李富威、刘月明、陈颖、吴亚君、韩建勋。 行业标准信息服务平台 I SN/T3729.10—2013 出口食品及饮料中常见 水果品种的鉴定方法 第10部分：香蕉成分检测 实时荧光PCR法 1范围 SN/T3729的本部分规定了出口食品和饮料（油、酒精等精加工食品除外）中香蕉成分的实时荧光 PCR检测方法。 本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中香蕉成分的定性检测。本部分所规定方 法的最低检出限（LOD)为1%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 宁业标准信息服务平台 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 香蕉Musaparadisaca 芭蕉科芭蕉属植物。 3.2 清汁clarifiedjuice 经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁。 3.3 浊汁cloudyjuice 未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） 1 SN/T 3729.10—2013 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate)。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]。 EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid)。 Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu）。 OD：光密度值（opticaldensity）。 5方法提要 样品经研磨后，提取DNA，以DNA为模板，采用香蕉的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR 扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中香蕉成分的检测鉴定，其中以香蕉果肉DNA 为阳性对照，以非香蕉来源的DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。 6试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 6.1检测用引物和探针：见表1。 表1引物探针序列 引物/探针 引物/探针序列（5→3"） 目的基因 内参照5端引物 CCTGAGAAACGGCTACCAT 内参照3°端引物 CGTGTCAGGATTGGGTAAT 真核生物18SrRNA基因 FAM-TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT-TAMRA 内参照探针 香蕉5端引物 TCGTCCCCTATTGGGATGC 香蕉3端引物 GTTTCGGCCTGCGCTTTAA 香蕉线绿体rbcL基因 香蕉探针 FAM-TGCACCGAAGCACT-MGB 6.2CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/LNaCl,0.1 mol/L Tris-HCI,0.02 mol/LNazEDTA, 文务平台 pH8.0。 6.3CTAB沉淀液:5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。 三氯甲烷（氯仿）。 6.5异丙醇。 6.670%乙醇。 6.7 蛋白醇K溶液（20mg/mL）。 6.8 NaCI 溶液(1.2 mol/L)。 6.9TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液）：10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0）。 6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U~2U的Taq酶、1XPCR缓冲液、 2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg²+、0.2 U~1 U 的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A,C,G)TPs、 2