SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3767.5—2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增（LAMP）检测方法 第5部分：玉米GA21品系 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 5:Maize GA21 标准信息服务平台 2014-01-13发布 2014-08-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3767.5—2014 前言 第1部分：通用要求和定义； 第2部分：筛选方法； 第3部分：玉米Bt-11品系； 第4部分：玉米Bt176品系； 第5部分：玉米GA21品系； 第6部分：玉米MIR162品系； 第7部分：玉米MIR604品系； 第8部分：玉米MON810品系； 第9部分：玉米MON863品系； 第10部分：玉米MON88017品系； 第11部分：玉米MON89034品系； 第12部分：玉米T-25品系； 第13部分：玉米3272品系； 第14部分：玉米59122品系； 第15部分：大豆A2704-12品系； 第16部分：大豆A5547-127品系； 第17部分：大豆DP356043品系； 第18部分：大豆GTS40-3-2品系； 第19部分：大豆MON89788品系； 业标准信息服务平台 第20部分：水稻Bt-63品系； 第21部分：水稻KF6品系； 第22部分：水稻KF8品系； 第23部分：水稻KMD品系； 第24部分：水稻LLRICE62品系； 第25部分：水稻M12品系； 第26部分：水稻T1C-19品系； 第27部分：水稻T2A-1品系； 第28部分：小麦B73-6-1品系； 第29部分：甜菜H7-1品系； 第30部分：油菜RT-73品系。 本部分为SN/T3767的第5部分。 本部分按照GB/T1,1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人：邵碧英、陈文炳、高东微、张舒亚、李志勇、常彦磊、刘津、凌莉、郑晶、缪婷玉、彭娟。 I SN/T3767.5—2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增 （LAMP）检测方法 第5部分：玉米GA21品系 1范围 (LAMP）初筛检测方法。 本部分适用于玉米及其制品中转基因玉米GA21品系特异性的定性检测。 本方法的定性检测低限为0.5%（质量分数）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.5转基因产品检测核酸定量PCR检测方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T2668转基因植物品系特异性检测方法 佳信息服务平台 SN/T3767.2一2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第2部分：筛 选方法 3防污染措施 环介导等温扩增检测过程的防污染措施应符合GB/T19495.2的规定。 4抽样与制样 按照GB/T19495.7的规定执行。 5核酸提取纯化 按照GB/T19495.3的规定执行。 SN/T 3767.5—2014 6LAMP检测方法 6.1原理 6.1.1一般原理 根据转基因玉米GA21品系外源基因序列设计特异性内、外引物和环引物各一对，特异性目标序列 和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别目标序列上的六个独立区域，利用BstDNA聚合酶启动 循环链置换反应，在玉米GA21品系特异目标序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成 有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg+结 合，产生副产物（焦磷酸镁），形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 6.1.2显色液显色原理 SYBRGreenI是一种高灵敏的DNA荧光染料，可以嵌人方式结合到双链DNA的小沟内。当它 与双链DNA结合时，荧光信号是游离状态的800～1000倍。在不发生扩增反应时，SYBR染料分子的 荧光信号不发生改变，颜色显现为橙色；当发生扩增反应时，随着双链DNA的增加，SYBR染料的荧光 信号也随之大幅度增强，其信号强度可代表双链DNA分子的数量，同时颜色由橙色变为绿色。 6.2仪器和设备 6.2.1走 超纯水发生器。 6.2.3 离心管：0.1mL1.5mL。 6.2.4 移液器：量程0.5μL～10uL；量程10μL～100μL；量程100uL～1000μ。 6.2.5 5计时器。 6.3 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂 6.3.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.3.2 6.3.3BstDNA聚合酶（如：NEB公司或具有同等效果的DNA聚合酶）：酶浓度8U/μL。 6.3.410ThermolPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl（pH值为8.8），100mmol/L硫酸铵、 100mmol/L氯化钾、20mmol/L硫酸镁、1%TritonX-100。 6.3.5硫酸镁溶液：100mmol/L。 6.3.6甜菜碱：5mol/L。 6.3.7显色液：SYBRGreenI荧光染料，1000。 6.3.8引物：根据转基因玉米GA21品系外源基因序列设计一套特异性引物，包括外引物1、外引物2、 内引物1、内引物2、环引物1和环引物2。 外引物扩增片段长度：197bp 外引物1(F3,5-3'）:GCTGTAGTTGTTGGCTGT 外引物2(B3,5-3'):CCTTTTAACTGATGTTTTCACTT 内引物1(FIP,5’-3'):TGGGGGATCCACTAGTTCTAGAG-GTGGAAAGTTCCCAGTTGA 内引I物2(BIP,5’-3'):GCAGGTCGAGGTCATTCATATG-GACCAGGTAATCTTACCTTTG 环引物1(FLP,5’-3'):CTGCACTTCCTCTTTAGCATCC 2