SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3750—2013 苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Botryosphaeria stevensii Shoemaker 行业标准信息服务平台 2013-11-06 发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3750—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：王卫芳、张秋娥、黄英、严进、华丽、 行业标准信息服务平台 SN/T3750—2013 苹果壳色单隔孢溃疡病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了植物检疫中苹果壳色单隔孢溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于苹果壳色单隔孢溃疡病菌所有寄主植物的原木、枝条、苗木和果实的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3原理 依据苹果壳色单隔孢溃疡病菌的为害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态进行该病菌的检 疫鉴定。 4试剂及仪器设备 4.1培养基及试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA：每1000mLPDA由200g去皮马铃薯，20g葡萄糖，18g琼脂配 制而成）、燕麦琼脂培养基（OA：每1000mL0A由30g燕麦片，20g琼脂配制而成），100%乳酸、1% 4.2仪器与设备 服务平台 立体显微镜、生物显微镜（具油镜和测微尺）、普通天平（感量0.1g）、超净工作台、生物培养箱、高压 灭菌器、载玻片、盖玻片、打孔器（直径4mm）。 5检疫与鉴定 5.1症状检查 检查抽取的原木、木制品、枝条和苗木树皮的表面是否有溃疡，枝条是否有枯死症状，检查果实是否 有腐烂症状（症状描述和图片参见A,3、图B.1） 按SN/T2122抽样，将有可疑症状的样品带回实验室作进一步检验。 5.2实验室鉴定 5.2.1样品中的病菌形态学观察 从树皮上采集子实体，横切片后，将切片组织转移到滴有无菌水的载玻片上，在常温下晾干后加 1 SN/T3750—2013 1滴100%乳酸并盖上盖玻片，制成非永久性玻片。观察子实体（尤其是子座）的形态特征，记录分生孢 子、产孢细胞或者子囊、子囊孢子的形态。分别测量50个子囊孢子、子囊、分生孢子和产孢细胞、10个 无性型子座和10个有性型子座的天小，拍摄并保存数码照片，同时将子实体转入培养基中纯化保存。 5.2.2分离培养 在样品中如果没有发现病原菌的子实体，则采用组织分离培养法，分离病部的病原菌。取发病部位 的病健交界组织，切成4mm×4mm的小块，用1%的NaOCl表面消毒10min，无菌水冲洗3遍，置于 直径9cm的PDA平板上，每皿放4～6块，于25℃条件下12h黑暗/光照培养，将长出的菌落边缘的 菌丝转至新的PDA平板上纯化。 5.2.3分离物培养性状和形态学观察 将纯化后的菌株在PDA平板上培养6d,采用火焰消毒的打孔器从菌落上打取直径4mm的菌丝 体块，转移到新的PDA平板上，在全黑暗条件下，分别于20℃、25℃进行培养，每处理重复3次，观察 菌落形态、计算菌落的生长速度、分生孢子器形成的速度。待分生孢子器形成后，观察分生孢子器及分 生孢子的形态，测量其大小，拍摄并保存数码照片。 6鉴定特征 6.1菌落特征 在PDA平板上，菌落圆形，初期白色，培养5d～6d后呈深橄榄色，且有大量的气生菌丝生成，在 的大量黑褐色分生孢子器。培养至9d少量的分生孢子器顶部即现白色黏稠状分生孢子团，培养至 6.2无性繁殖器官的形态 分生孢子器，单生或聚生，埋生于黑色的子座上，成熟时部分开裂，深褐色至黑色，近球形，直径可达 600um，壁由三层组成，外层黑褐色，由厚壁细胞组成，中间层由深褐色的薄壁细胞组成，内层由透明的 薄壁细胞组成。孔口居中，圆形，具乳突。分生孢子梗圆柱形透明，无隔膜，极少数分支具隔膜。产孢 细胞[（11～）12～15]um×（4～5）um，外生芽殖型产孢，离散圆柱形透明，光滑，无限生长。分生孢子 器成熟后喷射出白色分生孢子团。分生孢子透明，光滑，厚壁，长椭圆形至卵形，大小[（23.5）25.1～ 25.7（~27.4）Jμm×[（12.4~）13.2~13.5（~14.3）lμm，平均大小为（25.4±1.0）μm×（13.4±0.5）μm， 长/宽比率为1.9士0.1。分生孢子初无色透明，无隔膜，随着培养时间的延长，分生孢子转为褐色，多具 1隔膜，少数2~3隔膜。 6.3有性繁殖器官形态 在自然条件下，如树皮的坏死部位，无性型和有性型可同时产生于同一子座内或不同的子座内。子 囊座单腔室，单生或聚生，埋生，成熟时部分开裂，球形，直径可达300μm，深褐色至黑色，壁厚，外层由 深棕色的厚壁细胞组成，内层由透明的薄壁细胞组成。孔口中生，圆形，具乳突。拟侧丝透明，具分支， 具隔膜，宽2um~3um。子囊棍棒状，具柄，双囊壁，大小为（100～160）μm×（14~22）μm（包括柄），内 含8个子囊孢子，双侧排列。子囊孢子大小为[（24.8～）30.8~32.1（~36.2）um×[（9.5～）11.2~11.7 （～13.4）um，长宽比为2.8士0.3，梭形，中间宽，两端钝圆，透明，壁薄，光滑，初期无隔膜，后期变为淡 褐色具1隔膜，极少数有2个隔膜（病菌的有性型形态图参见图B.4）。 2