SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3690—2013 转基因大米PCR-DHPLC检测方法 PCR-DHPLC method for detection of genetically modified rice 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3690—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 国家纳米科学中心、深圳博睿祥晖生物技术有限公司、辽宁农业科学研究院。 本标准主要起草人：凌杏园、章桂明、朱水芳、潘广、向才玉、程颖慧、龙海、黄新、汪朝晖、朱劲松、 欧阳辉、缪建馄。 行业标准信息服务平台 SN/T3690—2013 转基因大米PCR-DHPLC检测方法 1范围 本标准规定了产品中转基因大米成分的PCR-DHPLC检测方法。 本标准适用于产品中转基因水稻品系LLrice62、科丰6号、科丰8号、克稻KMD1和Bt汕优63 大米的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 变性高效液相色谱技术DenaturingHigh-performanceLiquidChromatography;DHPLC 一种应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离的简单、快速、非凝胶的核酸分析方法。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BAR：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因（phosphinothricinacetyltransferasegene） bp：碱基对（basepair) CaMV35S：来自于花椰菜花叶病毒的35S启动子（35Spromoterfromcauliflowermosaicvirus） CrylA（b）：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA（b）基因［asyntheticgeneencodedthefirst648 amino acids,insecticidal-active truncated product identical to that of CrylA （b)gene of Bacillus thuringiensis subsp,Kurstaki strain HD-1] CryIA（b）/CrylA（c）：苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白crylA（b）和cryA（c）融合基因 CrylA（c）：苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白crylA（c）基因［asyntheticgeneencodedthe29to613 amino acids, insecticidal-active truncated product identical to that of CrylA (c) gene of Bacillus thuringiensis] Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（C：Cycle，t：threshold） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） 1 SN/T3690—2013 dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate） dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate） EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) Gos9：一种水稻根部表达的基因 GUS：β-D-葡萄糖醛酸酶基因（beta-D-glucuronidasegene） NOS：胭脂碱合酶基因终止子（terminatorofnopalinesynthasegene) NPTII：新霉素-3'-磷酸转移酶基因（neomycin-3'-phosphotransferasegene) PCR：简称PCR(polymerasechainreaction) TEAA：三乙基铵醋酸盐 Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu） TE:Tris-HCI、EDTA缓冲液 TM：熔解温度（meltingtemperature） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane UNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG)酶（uracil-N-glycosylase） 4方法提要 采用普通PCR方法对样品中转基因大米成分的各检测位点进行扩增，扩增产物通过DHPLC（变 性高效液相色谱技术DenaturingHigh-performanceLiquidChromatography）进行分析。DHPLC是 种应用离子对反相液相色谱原理对DNA片段进行分离的简单、快速、非凝胶的核酸分析方法。样品扩 增DNA的碱基对数量决定样品峰的洗脱顺序，随着洗脱时流动相中乙睛浓度的提高，扩增DNA片段 将按分子量从小到大的顺序被洗脱下来。通过与标准分子量比较确定得到洗脱峰DNA片段大小，从 而判定样品是否含有转基因大米成分和其所来源的转基因水稻品系。 标准信息 5主要设备及试剂 5.1主要设备 PCR仪：变性高效液相色谱分析仪；低温冷冻高速离心机；紫外分光光度计；制冰机；纯水机；移液 器(2μL,10μL,20μL,100μL,200μL,1000μL)。 5.2主要试剂 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。实验用 水应符合GB/T6682中一级水的规格。 5.2.1CTAB提取缓冲液:CTAB20g/L,氯化钠81.9g/L,Tris12.1g/L,Na2-EDTA7.5g/L,PVP-40 20g/L，pH8.0，高压灭菌，使用前加终浓度2%的β-巯基乙醇。 5.2.2TE缓冲液:Tris1.21g/L,Na2-EDTA 0.372g/L,pH8.0。 5.2.3pH7.0 Tris饱和酚。 5.2.4三氯甲烷/异戊醇（24：1）。 5.2.5 70%乙醇。 5.2.6RNA酶:10 mg/mL。 2