SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 36812013 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Acidovorax konjaci (Goto, 1983) Willems,et al.1992 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3681—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 疫局。 本标准主要起草人：甘琴华、厉艳、邵秀玲、封立平、刘彩霞、王英超、赵晖、李凤新、纪瑛。 行业标准信息服务平台 SN/T3681—2013 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了进出境植物及其产品中魔芋细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境魔芋细菌性叶斑病菌寄主植物及其繁殖材料中该病菌的检疫和鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 SN/T1157进出境植物苗木检疫规程 3魔芋细菌性叶斑病菌基本信息 学名:Acidovorarkonjaci（Goto,1983）Willems，etal.1992. 异名:Pseudomonas avenae subsp.konjaci(Goto,1983)Hu, et al.,199l;Acidovorar avenae subsp. konjaci; Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp. konjaci Goto 1983. 分类地位：原核生物界（Procaryotae）、薄壁菌门（Gracilicutes）、暗细菌纲（Scotobacteria）、假单胞杆 菌目（Pseudomonadales）、假单胞杆菌科（Pseudomonadaceae）、嗜酸菌属（Acidovorar）。 传播途径：带菌的种芋是远距离传播主要途径。在田间和温室，主要通过灌溉水、雨水、风力、修剪 枝等传播，由伤口、气孔和自然裂口侵人寄主组织。 魔芋细菌性叶斑病菌的其他信息参见附录A。 4方法原理 根据症状现场采集病样，实验室开展分离培养纯化，及革兰氏染色、生理生化、致病性测定和分子生 物学的检测，鉴定特征吻合，检测结果为阳性的，判定为魔芋细菌性叶斑病菌。 5仪器用具和主要试剂 5.1仪器及用具 生物显微镜、具透射光源的体视显微镜、超净工作台、电子天平、光照恒温培养箱、PCR扩增仪、电 泳仪、凝胶成像仪、高压灭菌器、酒精灯、培养皿（直径：7.0和9.0cm）、医用注射器（10mL）、针头 （18号）、医用手术剪、镊子、解剖刀、烧杯（500mL）、试管（直径12mm）、载玻片、盖玻片、量筒 (500 mL)。 5.2主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。蒸馏水、蛋白陈、0.1%次氯酸钠或75%乙醇、PPSM培养基、 1 SN/T 3681—2013 YP培养基、金氏B(KB)培养基。培养基配制方法见附录B。 6王 现场检测 6.1抽样 块茎或植株按SN/T1157中的规定进行抽样。 6.2症状检查 首先应查看植株是否萎，检查植株的根茎叶等各个部位，叶片是否有斑点、下垂，根、茎或块茎是 否腐烂。如果发现上述任何一种症状，切取或将整棵植株取回实验室检验。 7 实验室检测 7.1病原菌的分离培养 7.1.1病原菌的分离 用灭菌剪刀（或解刀）剪取可疑症状的植物组织，取表层组织切成约2mm小块，先用75%的乙 醇浸泡30s表面消毒，捞出后用无菌水洗3次，最后把病组织置放在装有2mL1%蛋白陈水溶液的无 后，检查是否有菌落产生。 7.1.2菌种纯化 采用平板划线法，即用无菌的接种环蘸取穹隆状、全缘、中央部淡紫桃色、周边透明的菌落后，在 YP或KB平板上多次划线纯化，28℃恒温培养2d～3d，移出单个菌落后进一步扩大繁殖。 7.2革兰氏染色反应 按GB/T4789.28—2003中的2.2进行实验。 7.3生理生化测定 分离菌的生理生化测定，可结合实验室条件，选用以下任一方法进行。 应用生化管或微量发酵管进行分离菌的生理生化测定。A.komjaci标准菌株革兰氏反应阴 性，氧化酶反应阳性，能分解丙二酸，不能利用D-半乳糖、2-氨基乙醇。若上述特征符合则选 取可疑菌落作进一步鉴定。 应用BIOLOG全自动微生物鉴定系统鉴定分离菌。按BIOLOG规定的操作方法进行：如果 24h鉴定结果为A.konjaci，则判定该分离菌BIOLOG鉴定结果为阳性，选取可疑菌落作进 一步鉴定。 7.4致病性测定 将培养24h～48h的分离菌用灭菌水配成浓度为10°CFU/mL～108CFU/mL的菌悬液，用注射 法接种到具2～3片真叶的健康魔芋苗叶片上，分别设置阴性对照和空白对照。接种后植株在27℃～ 种部位开始出现小的水浸状病斑，5d～7d后非接种部位出现病斑，随着时间的延长，病斑迅速扩展蔓 延，1周后病斑达到(10mm～20mm）×（2mm4mm）的大小。 2