SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3679—2013 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Colletotrichum kahawae J.M.Waller et Bridge 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3679—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫 局、华南农业大学。 本标准主要起草人：彭仁、程颖慧、李敏慧、习平根、张卫东、廖力、黎财慧、乐海洋、吴长坤、张建军、 冯欣、石振。 行业标准信息服务平台 SN/T3679—2013 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了咖啡种子及无性繁殖材料上的咖啡浆果炭疽病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于咖啡浆果炭疽病菌的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1809进出境植物种子检疫规程 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 3 咖啡浆果炭疽病菌基本信息 学名：ColletotrichumkahawaeJ.M.WalleretBridge 异名：Colletotrichumcoffeanumvar.virulans 分类地位：真菌界（Fungi），无性型真菌（Anamorphicfungi），炭疽菌属（Colletotrichum）。 传播途径：咖啡浆果炭疽病菌可以通过寄主植物的花、叶、枝条、果实以及种子带菌传播。 行业标 其他信息参见附录A。 4方法原理 根据症状检查、保湿培养、分离培养、分生孢子萌发试验、碳源代谢试验等方法对病原菌进行鉴定。 信息服务 5仪器和用具 5.1仪器 体视显微镜、光学显微镜（带显微照相装置）、测微尺、天平（感量0.1g）、超净工作台、光照培养 箱等。 5.2用具 手持放大镜、滤纸、烧杯、培养血、三角瓶、镊子、剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管等。 6试剂和培养基 6.1试剂 琼脂、麦芽糖、1.25%次氯酸钠、70%乙醇、糊精、蛋白陈、丙三醇、柠檬酸、酒石酸铵、漠甲酚紫、氢氧 1 SN/T3679—2013 化钠、磷酸二氢铵、氯化钟、硫酸镁等。 6.2培养基 PDA），水琼脂培养基（WaterAgar，WA），各培养基配方参见附录B。 7现场检疫 按照SN/T1809及SN/T2122的规定结合症状检查进行抽样，重点检查花、叶、枝条、果实等，咖 啡浆果炭疽病菌侵染后会产生黄褐色凹陷病斑或坏疽状病斑等，详细症状参见附录A。抽取代表性样 品送实验室检验。 8病原菌鉴定 8.1症状检查 对于有病征出现的病部，用解剖针挑取或用刀片刮取病组织表面的小黑点或分生孢子团制片，置于 显微镜下镜检。 8.2保湿培养 无上述明显症状或看似健康的寄主组织材料，进行保湿培养。将寄主组织材料充分湿润后，置于垫 有3层湿滤纸的塑料盒或袋中，在25℃、密闭条件下培养，观察症状的变化，进行显微镜检及病原菌的 分离培养。药剂处理过的种子需先洗去表面的种衣剂，再按照上述方法保湿培养。 8.3分离培养 直接挑取病部的分生孢子盘或分生孢子团置于PDA平板上；或采用组织分离培养法，取新鲜病组 织，冲洗掉表面的泥土杂物后，用剪刀或解剖刀切取病健交界处组织，切成5mm见方小块，用70%的 酒精溶液浸泡30S，经灭菌水洗涤后，移至PDA平板上，每血5～10片，在25℃、黑暗条件下培养；对种 子样品可先将种子切开，用有效成分为1.25%的次氯酸钠溶液表面灭菌3min～4min后，用灭菌水洗 涤两次，移至PDA平板上，每Ⅲ4～5粒，进行分离培养。待上述分离培养长出菌丝后纯化再转至MEA 培养基上培养7d～14d,观察其纯培养性状及病菌形态学特征。 8.4分生孢子萌发试验 直接挑取病组织产生的分生孢子团，或取少许培养产生的新鲜分生孢子用无菌水配成孢子悬浮液 将融化的1%水琼脂培养基滴一滴于经灭菌的载片上，并迅速让其展开，再滴孢子悬浮液予展开的水琼 脂上，置培养皿中保湿，温度控制在25℃、黑暗条件下培养24h后，在显微镜下检查分生孢子萌发产生 附着胞的情况。 8.5碳源代谢试验 利用柠檬酸盐或酒石酸盐作为唯一碳源进行试验，具体方法参见附录C。 9鉴定特征 9.1病菌形态 分生孢子无色单胞，圆柱形或卵圆形，顶端钝圆，基部钝圆或稍尖，（12.5μm～19μm）×4μm；有部 2