SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3639—2013 出口食品中空肠弯曲菌的检测方法 实时荧光PCR法 Determination of Campylobacter jejuni in food for export- Real-timePCRmethod 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3639—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心、中华人民共和 国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检 疫局、中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国吉林出入境检验检疫局，中华人民共和 国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海辉睿生物技术有限公司。 本标准主要起草人：蒋原、祝长青、王毅谦、张睿、唐泰山、邵景东、沈涛、石建华、栾军、郭云昌、 朱金国、王振国、薛峰、陈国强、郑文杰、陈广全、刘军义、李寿崧、刘秀梅、黄晓蓉、雷质文、李辉。 行业标准信息服务平台 SN/T3639—2013 出口食品中空肠弯曲菌的检测方法 实时荧光PCR法 1范围 本标准规定了食品中空肠弯曲菌（Campylobacterjejuni）的实时荧光PCR方法。 本标准适用于食品中空肠弯曲菌的基因检验。 2夫 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T4789.9食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T0175进出口食品中弯曲菌的检测方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3防污染措施 检验过程的防污染措施应符合SN/T1193 业标准信息服务平台 4 实验方法 4.1 设备与材料 4.1.1 实时荧光PCR仪。 4.1.2 超净工作台。 4. 1.3 消毒灭菌锅。 4. 1. 4 制冰机。 4. 1.5 核酸蛋白分析仪。 4. 1. 6 高速冷冻离心机：转速≥8000r/min；台式小型离心机：转速≥13000r/min。 4. 1. 7 低温冰箱，冷藏冷冻冰箱。 4. 1. 8 纯水器，双蒸水器。 4. 1.9 旋涡振荡器。 4. 1. 10 微量移液器。 4. 1.11 无Dnase/Rnase的光学PCR反应管或板。 4. 2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。 1 SN/T3639—2013 4.2.1实验用水：应符合GB/T6682中一级水的规格 4.2.2PCR缓冲液。 4.2.3 MgCl2 4.2. 4 dNTPs(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)。 4.2.5 Taq酶。 4.2.6引物： 上游引物：5'-AAATAGGACTTCGTGCAGATATGG-3" 下游引物5²-ACAATCCATCTTCTATCATTGCCT-3 4.2.7探针：（荧光报告基团）-5²-AGCACCACCCAAACCCTCTTCAGC-3-（荧光淬灭基团）。 4.2.8 DNA 提取液:50 mmol/L Tris.HCl(pH 8.0),100 mmol/L EDTA(pH 8.0),100 mmol/L NaCI,1%SDS. 4.2.9TE溶液(pH8.0):10mmol/LTris.HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0),高压灭菌。 4.2.10酚/三氯甲烷/异戊醇（体积比25/24/1）。 4.2.11异丙醇。 4.2.1275%乙醇。 5检测步骤 5.1样品处理、增菌和分离 样品处理、增菌与分离步骤参照GB/T4789.9或SN/T0175进行。 5.2模板DNA的制备 5.2.1增菌液模板DNA的制备 取待测样本1mL加到1.5mL离心管中，8000r/min离心3min，尽量弃去上清液。加人750μL DNA提取液，65℃温浴30min，加酚：氯甲烷：异戊醇（25：24：1）500μL，振荡混匀，13000r/min 沉淀一次，13000r/min离心5min，弃去上清，沉淀干燥后溶于30uLTE溶液中，立即用于检测或短 期保存于一20℃。 注：也可使用其他经验证的DNA提取方法或等效的商品化细菌DNA提取试剂盒，按照其使用说明操作。 5.2.2纯菌落模板DNA的制备 用一次性器具从分离平板上挑取5个菌落，转人盛有30μL灭菌超纯水的离心管中，煮沸5min，转 入冰水浴中5min，13000r/min离心3min，吸取上清液备用。 5.3实时荧光PCR检测 5.3.1反应体系体积为25μL，10XPCR缓冲液2.5μL,Mg+浓度为2.5mmol/L，引物对（10μmol/L） （10μmol/L）0.6μL,DNA2μL（约50ng～100ng）。用灭菌的超纯水补足反应体积。 5.3.2反应条件为95℃预变性5min，94℃变性10s，59℃退火延伸40s，同时收集荧光信号，进行 45个循环，4℃保存反应产物。 5.3.3反应体系与条件可以根据仪器型号或反应预混液类型进行等效评估，进行适当的参数调整。 5.3.4检测过程中分别设阳性对照、阴性对照与空白对照。阳性对照为扩增基因的阳性克隆分子 2