SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3674—2013 凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Impatiens necrotic spot virus 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3674—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局 本标准主要起草人：李晏、丁元明、张巧萍、寸东义、邓裕亮、曹云华、杜宇、刘忠善、和捷 行业标准信息服务平台 SN/T3674—2013 凤仙花环死斑病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了凤仙花坏死斑病毒检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗和苗木中凤仙花坏死斑病毒的检疫 与鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 中文名：凤仙花坏死斑病毒 学名：Impatiens necrotic spotvirus 缩写:INSV 分类地位：布尼亚病毒科（Bunyaviridae），番茄斑萎病毒属（Tospouirus）。 INSV的血清学特性和分子生物学特征（参见附录A）是检疫鉴定该病毒的主要依据。 业标准信 4 仪器设备、用具和试剂 4.1仪器 电子天平（0.0001g）、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、高速冷冻离心机、超低温冰箱、微波炉、 酶标仪、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像系统、实时荧光PCR仪。 4.2用具 可调式微量移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL）及相应的无RNase吸头、无RNase离心 管、PCR管、酶联板和研钵等。 4.3试剂 去离子水或蒸馏水应符合GB/T6682中的三级水的要求，超纯水应符合GB/T6682中一级水的 要求。 所用试剂为INSVDAS-ELISA检测试剂盒、Trizol、DEPC、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、 M-MLV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA分子量标准、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。除有特殊说明 外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。没有INSVDAS-ELISA检测试剂盒的，血清学试剂的配制方法 见附录B,分子生物学试剂配制见附录C。 1 SN/T 3674—2013 5检疫鉴定方法 5.1双抗夹心酶联免疫吸附检测（DAS-ELISA） 性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为样品抽提缓冲液。 具体操作步骤见附录B。 5.2分子生物学检测 注：实际检测中，可视实验室条件选用以下两种方法中任意一种进行。 5.2.1巢式RT-PCR检测 提取样品的总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，再将 同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超纯水。 具体操作步骤见附录C。 5.2.2实时荧光RT-PCR检测 提取样品的总RNA，以RNA为模板反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR 检测。同时设阴性对照、阳性对照和空白对照，阴性对照为同样处理的健康组织汁液，空白对照为超 纯水。 具体操作步骤见附录D。 行业标 6 结果记录与判定 6.1结果记录 DAS-ELISA检测记录各检测反应孔的光密度值，巢式RT-PCR检测有电泳结果照片，实时荧光 RT-PCR应有扩增曲线等原始数据。 6.2结果判定 6.2.1样品经DAS-ELISA检测为阴性时，判定样品为凤仙花坏死斑病毒阴性。 6.2.2样品经DAS-ELISA检测为阳性、巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阴性时，判定 样品不携带凤仙花坏死斑病毒。 6.2.3样品经DAS-ELISA检测为阳性、巢式RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性时，判定 样品携带凤仙花坏死斑病毒。 7样品保存 经检验确定携带风仙花坏死斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。种子保存在干燥条件 下，其他的组织样品（如叶片等）保存在一20℃冰箱中，有条件的保存在一80℃冰箱中更好。做好登记 和标记工作。 2