SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3647—2013 PCR 法 鲨鱼动物源性成分检测方法 Detection of shark derived materialPCR method 行业标准信息服务平台 2013-08-30发布 2014-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T3647—2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国江苏出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：张舒亚、黄文胜、陈颖、祝长青、郭云霞、谌鸿超、吕蓉、李想、高琴、刘月明。 行业标准信息服务平台 SN/T 3647—2013 鲨鱼动物源性成分检测方法 PCR法 1范围 本标准规定了原料及食品中鲨鱼动物源性成分的PCR鉴定方法。 该检测方法的检出限为0.1%。 23 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid) dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷（tris（hydroxymethyl)aminomethane） EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticu） OD：光密度值（opticaldensity） 4方法提要 利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，无水乙醇沉淀得到DNA：以提取的DNA为模板进行 PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用核苷酸序列测定进行确证。 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均 用无DNA酶污染的容器分装。 5.1十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)。 5.2三羟甲基氨基甲烷（Tris）。 5.3乙二胺四乙酸（EDTA)。 5.4氯化钠(NaCI)。 5.5三氯甲烷（氯仿）。 1 SN/T 3647—2013 5.6 异丙醇。 5.7 无水乙醇。 5.8 70%乙醇。 5.9 裂解液:1%CTAB,0.05 mol/L Tris-HCl(pH 8.0),0.7 mol/L NaCl,0.01 mol/L EDTA 5.10 NaCl溶液(1.2mol/L)。 5.11 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA 缓冲液):10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),1 mmol/LEDTA(pH 8.0) 5.12 分子量标准品（100bp～2000bp）。 5.13 琼脂糖：电泳纯。 5.14 溴化乙锭。 5.15 电泳缓冲液：Tris54g，硼酸27.5g，0.5mol/LEDTA·Tris-HCl（pH8.0)20mL，加蒸馏水至 1000mL;使用时10倍稀释。 5. 16 加样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖水溶液。 5. 17 10XPCR 缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl(pH 8.4),200 mmol/L KCl,15 mmol/L MgCl2 . 5. 18 Taq DNA 聚合酶。 5. 19 dNTP混合液。 5.20 检测用引物（对）序列：鲨鱼成分扩增引物、内参照（真核生物18SrRNA基因）引物详见表1。 表1 试验用引物 名称 序列（5°-3"） 退火温度/℃ 内参照5端引物 TCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTA 54 内参照3°端引物 AATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTT 鲨鱼5端引物 CACCTTTAGGCAAACCAGCAC 64 行业标准信息服务平台 鲨鱼3'端引物 GGGCCAGGGTCGAATCTCT 6 仪器设备 6.1PCR仪。 6. 2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6. 3 恒温水浴锅。 离心机：离心力12000g。 6. 4 6.5 微量移液器（2.5μL，10μL，20μL,100μL200μL，1000μL）。 6.6 研钵及粉碎装置。 6.7 涡旋振荡器。 6.8 pH计. 6.9 电泳仪。 6. 10 紫外检测仪。 6. 11 天平：感量0.01g。 7 试样选取与制备 将实验样品粉碎，充分混合均匀后待用。 2