SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3589.1—2013 出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法 第1部分：石斑鱼成分检测 实时荧光PCR法 Identification of fish species in export food- Part 1: Detection of grouper ingredient-Real-time PCR method 业标准信息服务平台 2013-11-06 发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3589.1—2013 前言 SN/T3589《出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法》共分为7部分： 第1部分：石斑鱼成分检测实时荧光PCR法； 第2部分：安康鱼成分检测实时荧光PCR法； 第3部分：鲑鱼成分检测实时荧光PCR法； 第4部分：河豚鱼成分检测实时荧光PCR法； 第5部分：黄鱼成分检测实时荧光PCR法； 第6部分：金枪鱼成分检测实时荧光PCR法； 一 第7部分：鳕鱼成分检测实时荧光PCR法。 本部分为SN/T3589的第1部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共 和国上海出入境检验检疫局。 本部分主要起草人：陈双雅、张舒亚、陈伟玲、王群力、刘棠、彭小莉、徐敦明、周昱、陈颖、韩建勋。 行业标准信息服务平台 I SN/T 3589.1—2013 出口食品中常见鱼类及其制品的鉴伪方法 第1部分：石斑鱼成分检测 实时荧光PCR法 1范围 本部分适用于食品中4个属［石斑鱼属（Epinephelus）、宽额鲈属（Promicrops）、鳃棘鲈属（Plec- 鱼（Epinephelusmoara）、棕点石斑鱼（Epinephelusfuscoguttatus）、点带石斑鱼（Epinephelus lanceolatus）、豹纹鳃棘鲈（Plectropomusleopardus）、斑鳃棘鲈（Plectropomusmaculatus）和驼背鲈 （Cromileptesaltivelis）及其制品鉴伪的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 石斑鱼grouper 属鱼类，主要包括石斑鱼属（Epinephelus），喙鲈属（Mycteroperca）、九棘鲈属（Cephalopholis）、鳃棘鲈 属（Plectropomus）、侧牙鲈属（Variola）、纤齿鲈属（Gracila）、东洋鲈属（Niphon）、鲶属（Triso）等。石 斑鱼广泛分布于全球热带及亚热带海域，为定居性鱼类，无长距离洄游能力。目前石斑鱼的两大区系 （印度-西太平洋区系和大西洋-东太平洋区系）的石斑鱼种类基本不重复。我国近海有10个属约30多 种，主要分布于东海、南海。 3.2 实时荧光PCRreal-timePCR 在PCR扩增时加入带有荧光基团的特异性探针（Tagman探针）或荧光染料，使PCR产物的累积 与荧光信号的累积完全同步，实现PCR产物的实时监测。 3.3 Ct值cycle thresholdvalue 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。 1 SN/T3589.1—2013 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 COl：细胞色素氧化酶I亚基（cytochromeoxidasesubunitI) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate) dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate） dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticu) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane 5方法提要 提取样品DNA，以DNA为模板，采用石斑鱼特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观 察实时荧光PCR的增幅现象，判断样品中是否存在石斑鱼成分。 6仪器设备 6.1实时荧光PCR仪 6.2恒温水浴锅。 6.3离心机：离心力不小于12000g 6.4 微量移液器：0.5μL~10μL，10μl~100μ20μL~200μl，200μl~1000μl。 “准信息服务平 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 6.6 pH计。 6.7 天平：感量0.01g。 6.8 涡旋振荡仪。 7 试剂和材料 除另有规定外，所有实验使用的试剂等级应为不含DNA和DNase的分析纯或生化试剂。实验用 水应符合GB/T6682中一级水的规格。 7.1CTAB裂解液:20 g/LCTAB,0.1 mol/L Tris-HCl(pH为 8.0),1.4 mol/LNaCl,20 mmol/LED TA(pH 为 8.0)。 7.2CTAB沉淀液:5g/LCTAB,40mmol/LNaCl。 7.3蛋白酶K溶液(20 mg/mL)。 7.4 NaCI 溶液(1.2 mol/L)。 7.5 三氯甲烷（氯仿）。 7.6异丙醇。 2